不同检测方法在结核杆菌检测中的应用研究

欧阳慧 郭桂英 秦旭 黄鑫（通讯作者）

（1乐山市人民医院检验科 乐山 四川 614000（2乐山市人民医院分子实验室 乐山 四川 614000）

结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分歧杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。中国是全球22个结核病高负担国家之一,每年新发病例占全球总数的16%。结核病也是发展中国家流行的一种致死性疾病，现已成为世界严重公共卫生问题。近些年来，我国的结核病发病率呈缓慢的上升趋势，该病的传染性极强，传染方式简单，给人们的健康带来了重大的威胁[1]。一般来说绝大多数的感染在肺部，但皮肤，脑膜，腹膜等位置也可以发生感染[2]。有研究表明，结核病的延迟诊断给患者及亲密接触者造成严重不良后果，因此，早期的明确诊断具有重要意义[3]。痰标本简单，易获得，是一种常用的检测样本。而且检出痰中含有结核杆菌是临床诊断肺结核或鉴别与其他肺病的依据。本研究通过比较痰TB-DNA检测以及传统的痰抗酸染色对结核杆菌的检出率，为临床提供肺结核诊疗的最佳实验室检测方案。

1.资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年12月—2016年12月本院诊治的202例结核患者(男性患者167例，女性患者35例，汉族患者121例，少数民族患者81例)的临床资料（详见表1），依据临床表现及影像学等检查确诊为肺结核患者。按照不同检测方式分为PCR组和抗酸染色组。其中PCR组检测352份样本，抗酸染色组检测648份样本。

1.2 方法

1.2.1 采集痰标本 患者晨起后漱口，咳出1～2口痰至已进行过灭菌处理的无菌杯加盖送检，样本中避免混入唾液。

1.2.2 试剂和仪器 抗酸染色用5%石炭酸复红，3%盐酸酒精再加吕氏美兰液。PCR仪器为DA7600型全自动荧光定量PCR仪。

1.2.3 方法

（1）萋-尼氏抗酸染色法镜检，严格按照《结核病实验室诊断检验规程》操作。

（2）PCR检测 使用胰酶悬液消化痰标本。离心弃上清液得沉淀物用于TB-DNA提取，然后按设定程序进行DNA扩增和分析。

1.2.4 统计学处理 采用spss 13.0软件进行统计学处理，技术资料采用卡方检验χ²，P＜0.01为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 PCR法和抗酸染色法在痰抗酸杆菌检测中阳性率比较结果显示PCR法检出痰液里的结核分枝杆菌阳性率明显高于传统的涂片抗酸染色法，差异有统计学意义。（详见表2）

2.2 PCR法和抗酸染色涂片法检出结核病人阳性率比较202例结核患者中痰PCR检出阳性为72例，抗酸染色检出阳性53例，PCR的阳性患者检出明显高于抗酸染色。（详见表3）。

表1 202例确诊结核病人基本资料

表2 1000份痰标本两种不同检测法比较

表3 202例结核患者痰检测PCR和抗酸染色结果比较

3.讨论

结核病的细菌学检查是检测结核杆菌的主要手段，是结核病确诊和制定治疗方案的的重要依据。传统的抗酸染色是常用且简单易行的检测方法，但是特异性较差，不易区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，而且干扰因素多，漏检率很高，阳性率低。而要在金标准下进行结核杆菌培养，一般需要45天时间，且对培养要求很高，不易用作早期诊断手段，不太适用于临床。所以需要加入更有效，特异性更高且快速的方法加以辅佐，弥补其部分不足。而近年来有很多新的检测痰中结核杆菌的技术比如环介导等温扩增技术（LAMP），免疫磁珠分离技术(immunomagnefic beads separation techniques,IMBS) 等，都反映出能更好的检测痰中结核杆菌，但是其要用于基层医院的临床检测还需要更长的时间。

目前临床上应用较好的较成熟的是聚合酶链式反应基因扩增（简称PCR）对痰结核杆菌进行检测的方法，该方法的好处是利用较为稳定的痰结核DNA进行检测，通过对痰样本中的生物DNA进行提取，并以结核杆菌DNA的特异性寡核苷酸作为引物进行的基因扩增，可以检测到所提取的DNA提取物中是否含有要检测的结核杆菌DNA，这种方法大大提高了检测的准确性和可靠性，可为临床提供及时，准确的诊断依据，值得在临床实践中加以推广应用。为了广泛推广该项技术在临床的应用，提高临床医生对TB-DNA检测意义的认识。本研究通过比较结核病人痰抗酸染色和PCR两种检测方法检测抗酸杆菌的情况，结果显示PCR检测法明显优于传统抗酸染色。其操作方法简便，诊断快速，特异性较高，且检查结果具有较高的真实度和可靠性，表明PCR法对结核分枝杆菌的快速检测具有重要的意义。

综上所述,用PCR技术检测痰结核分枝杆菌具有较高的阳性检出率，检测特异性较高，临床操作简洁，耗时短且弥补了其他一些传统检测方法的不足，具有临床实际应用价值，是一种值得推荐和推广的实验室诊断技术，但是也有其局限性，就是易受外界干扰，还存在一定程度的不稳定性易产生假阳性。可以和抗酸染色一起作为结核病常规检测方法。

[1]陆再英，钟南山.内科学[M]第7版，北京：人民卫生出版社，2008:43.

[2]杨光武，不同检验方法在肺结核早期诊断中的应用[J].航天医学杂志，2012,23（3）,309-310.

[3]梁建琴，高华方，李洪敏，等.PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究[J].中国防痨杂志，2012,34(5):271-274.