姜黄素环糊精分子包合物的构建和优化

李 艺， 梅 虎， 赵春景， 王 红， 罗 文， 张景勍*

（1.重庆医科大学 药物高校工程研究中心，重庆 400016；2.重庆大学 生物工程学院，重庆 400023；3.重庆医科大学附属第二医院药剂科，重庆 400010）

姜黄素（curcumin，CCN）最早是从植物根茎提炼出来的一种印度香料，作为抗炎草药，具有悠久的使用历史。CCN溶于乙醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，几乎不溶于水及乙醚。药理作用广泛，安全有效性高，价格低廉，使其具有广阔的应用前景。但由于CCN的溶解度极低，使其口服吸收不完全，代谢消除迅速，生物利用度低，限制了其应用。药物被环糊精大分子包合后可明显改善药物的理化性质，提高药物的水溶性和稳定性，提高药物的生物利用度以及改变药物在体内的分布情况等。为了改善CCN在体内的吸收，提高其口服生物利用度，本实验选用水溶性大、生物相容性好的的羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl beta cyclodextrin，HBCD） 为材料，构建了姜黄素羟丙基-β-环糊精分子包合物（curcumin-cyclodextrin inclusion complexes，CCIC），通过显微观察法、红外光谱法、差示量热扫描法验证了包合物的形成，并优化了CCN的制备工艺，成功提高了CCN在水溶液中的溶解度，以计算机模拟了CCIC的分子结构及CCN分子包合前后的能量变化。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 主要材料、试剂 羟丙基-β-环糊精：江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司产品；姜黄素：陕西森弗生物制药有限责任公司产品；去离子水，其它试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器 Monobloc AB204-E型电子天平：瑞士METTLER-TOLEDO仪器公司产品；UV-3150型紫外分光光度仪：日本岛津公司产品；DZF-6020型真空干燥箱：上海博运实业有限公司医疗设备厂制造；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市于华仪器有限责任公司产品；UV-7504型紫外可见分光光度仪：上海精密科学仪器有限公司产品；光学显微镜：凤凰光学集团有限公司产品；STA 449C型综合热分析仪：德国耐驰仪器制造有限公司产品；WQF-510傅里叶变换红外光谱仪：上海第二光学仪器厂制造；THZ-82水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 含量测定方法的确定 精密称取CCN 11.1 mg加入适量乙醇溶液溶解，将其移入100 mL的棕色容量瓶中，并用乙醇稀释至刻度，摇匀制成储备液备用。取储备液稀释适当倍数，以乙醇溶液为空白对照，在200～800 nm进行紫外扫描得CCN紫外吸收光谱，确定最大吸收波长。取HBCD适量溶于乙醇中，以乙醇溶液为空白对照，在200～800 nm进行紫外扫描，确定辅料有无干扰。精密量取上述母液10 mL于100 mL的容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线， 稀释摇匀。 取该溶液 1、2、3、4、5 mL于10 mL的容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线，稀释摇匀。以乙醇溶液为空白对照，在425 nm处测吸光度，以CCN质量浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，绘制标准曲线。按线性范围分别配制高、中、低3种浓度的CCN乙醇溶液，在425 nm测定吸光度，计算实际浓度。同日内测定日内精密度，连续3 d测定日间精密度。称取已知含量的CCIC适量溶于乙醇溶液中，移入10 mL的容量瓶加乙醇溶液至刻度。取1 mL上述溶液分别于9个10 mL的容量瓶中。取CCN储备液1.1、1.4、1.7 mL于上述容量瓶中，每浓度设置3组平行，用乙醇定容至刻度线摇匀。取出适量用乙醇稀释后，于425 nm处测定吸光度值，代入回归方程求出药物浓度，并计算回收率。

1.2.2 CCIC中CCN含量的测定 精密称取CCIC适量溶于乙醇溶液中，移至10 mL的容量瓶中，用乙醇稀释至刻度摇匀。取上述溶液再用乙醇溶液稀释适当倍数，于425 nm处测定吸光度，代入标准方程，计算CCIC中CCN的含量。

1.2.3 CCIC包合物的制备 采用研磨法制备CCIC，称取适量HBCD加入少量蒸馏水，研磨均匀，再缓慢加入CCN，边加边研磨至规定时间，适当干燥，沉淀用乙酸乙酯洗涤3次，再于30℃真空干燥3 h，研细即得 CCIC[1]。

1.2.4 CCIC最佳制备工艺的选择 选择B投料比（CCN与HPCD的摩尔比）、C包合温度、D研磨时间这3种对包合物制备影响较大的因素作为考察对象，每因素各取3水平，采用L9（34）正交实验表设计实验方案，见表1。

表1 CCIC制备工艺因素-水平表Table 1 Prepare of CCIC levels of factors

按正交实验设计表进行试验，以CCN溶解度为考察指标，确定最佳制备工艺[2]。

1.2.5 相溶解度法测定CCN与HBCD的包合常数精密称取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol HBCD 溶于5 mL蒸馏水中，向上述溶液中加入过量CCN，放入恒温振荡器中（25±2）℃，振荡24 h使溶解达到平衡状态。取出溶液1 mL，微孔滤膜过滤，滤液用乙醇稀释至适当倍数，在425 nm处测定紫外吸光度。以CCN含量对HBCD含量作图，即得相溶解度图[3-5]。

1.2.6 溶解度测定 称取适量CCN溶于25 mL蒸馏水中制备成过饱和溶液，于磁力搅拌器上搅拌，不同时间取样1 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用乙醇稀释适当倍数，在425nm处测定吸光度值。溶解平衡时间为相邻样品测定的A值小于0.004时所对应的时间。按最优化处方工艺制备CCIC，称取适量溶于25 mL蒸馏水中制备成CCN过饱和溶液，同方法1.2.2取样并处理，测定吸光度值，计算得CCIC中CCN在蒸馏水中溶解度[6]。

1.2.7 包合物的鉴定 包合物的鉴定有显微观察法，差示量热扫描分析和红外分光光度法。显微观察法是分别取CCN、HBCD、CCN与HBCD物理混合物、CCIC在光学显微镜下观察。差示量热扫描分析是分别取CCN、HBCD、CCN与HBCD物理混合物、CCIC进行差示扫描量热分析，以Al2O3为参比，升温速度为10℃/min，氮气流速为20 mL/min，扫描范围为-20～350℃，取样量为5 mg。分别记录升温曲线。红外分光光度法是将CCN、HBCD、CCN与HBCD物理混合物、CCIC加入适量KBr压片，在4000～400 cm-1范围内累加扫描8次，分辨率为2 cm-1。

1.2.8 计算机拟合分子包合 采用基于CHARMm的能量产生模型模拟CCN和HBCD的化学结构计算包合前后的能量变化及可能的构象[7]。

2 结果与讨论

2.1 含量测定方法建立 CCN储备液以乙醇稀释后的紫外吸收光谱见图1，由图1可知CCN在425 nm处有最大吸收峰。HBCD的乙醇液在425 nm处没有吸收，不干扰CCN测定，所以选择425 nm为测定波长。以CCN质量浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，得线性回归方程A=0.149 3C+0.005 8，R=0.999 9。 CCN在1.1～5.5 μg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系，见图2。日内精密度结果见表2，日间精密度结果见表3。从表2和表3中可以看出，溶液高、中、低浓度日内RSD为0.91%、0.35%、0.58%；日间RSD为1.23%、0.47%、0.75%，精密度符合要求。平均回收率分别为99.42%、100.14%、100.12%，RSD 为 0.45%、0.92%、1.17%，见表4。

图1 CCN的乙醇溶液紫外扫描图Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of CCN ethanolsolution

图2 CCN的无水乙醇溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of the CCN in ethanol

表2 日内精密度测定结果Table 2 Result of the intra-day precision

表3 日间精密度测定结果Table 3 Result of the inter-day precision

表4 回收率试验Table 4 Recovery experiment

2.2 CCIC最佳制备工艺的选择

按正交实验设计表进行试验，以CCN溶解度为考察指标，确定最佳制备工艺。正交实验结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 正交试验结果Talle 5 Result of the results of orthogonal experiment

表6 方差分析结果Table 6 Results of analysis of variance

由表5正交实验结果可知因素B包合投料比的极差R最大，所以其对包合实验的影响最大，其次依次为因素D研磨时间和因素C包合时间。由表6方差分析结果可知3种因素对实验均有显著影响（P＜0.05）。实验结果较大者为最优处方，根据结果确定最优处方工艺为B1C2D3。即包合投料摩尔比为1∶1，研磨温度为40℃，包合时间为1.5 h。按照最优化处方工艺B1C2D3重复制备3批CCIC，用“1.2.6溶解度测定”中方法测定每批CCIC溶解度，得到最优化处方工艺下CCN的溶解度为（1.72±0.03）mg/mL。

药物与环糊精一般形成1∶1或1∶2的包合物。由相溶解度法测定CCN与HBCD的包合常数，得到CCN与HBCD形成包合物的理论摩尔比为1∶1。而通过正交试验也验证了当CCN与HBCD的投料摩尔比为1∶1时，形成的CCIC有最大溶解度。

由正交试验得出制备CCIC的最优工艺为：包合投料摩尔比为1∶1，研磨温度为40℃，包合时间为1.5 h。随包合时间增加，包合效果也增加。而随温度的增加，包合效果却是先升高后降低，可能是由于CCIC在较高温度下不稳定。

2.3 相溶解度法测定CCN与HBCD的包合常数

相溶解度图见图3。

图3 CCN相溶解度曲线Fig.3 Phase solubility diagram of the CCN

由图3可知CCN溶解度随HBCD的增加而增加。CCN溶解度对HBCD浓度作图为直线，二者具有线性关系。直线方程为y=0.001x+0.000 4，R2=0.999 4＞0.990 0为AL型。形成包和物的化学计量比为1∶1。由包合平衡常数K=斜率/截距（1-斜率）[8]得出 K=2.50×103L/moL。

K1∶1的数值范围在 0～1.00×105L/moL，包合平衡常数K越大，药物与环糊精形成的包合物越稳定。当包合平衡常数K小于80 L/moL时，则药物不适宜制备成包合物。相平衡溶解度法测得CCN与HBCD包合平衡常数K=2.50×103L/moL，包合平衡常数较大，形成的包合物较稳定。

2.4 溶解度测定

实验表明CCN达到溶解平衡的时间为30 min。按最优化处方工艺制备CCIC中CCN在蒸馏水中溶解度为（1.76±0.02） mg/mL（n=3）。

2.5 包合物的鉴定

显微观察法显示：在光学显微镜下观察，CCIC为不规则形状，明显不同于CCN和HBCD的简单物理混合物，证明形成了CCIC。差示量热扫描图谱见图4。CCN在175℃有一个吸热峰，为药物的熔融峰。CCN与HBCD物理混合物在该温度时有此吸热峰，而在CCIC中该吸热峰前移，峰型也明显减小，表明CCN与HBCD形成了包合物。红外分光光度法图谱见图5。通过比较药物包合前后在红外区吸收的特征差异，根据吸收峰的变化情况（吸收峰的降低、位移或消失），以此证明药物与环糊精是否产生包合作用。在包合物图谱中药物特征吸收峰1 207 cm-1峰消失，1 510、1 457、1 282、1 153cm-1峰强度明显减弱，表明CCIC形成。

图4 差示扫描量热图Fig.4 Differential scanning colorimetry analysis

2.6 计算机拟合分子包合物

计算机模拟研究结果说明包合后体系能量下降了约175.728 kJ/mol，提示HBCD可能包合CCN后形成了CCIC，其可能的构象见图6。CCN和HBCD的化学结构包合前后的能量变化见表7。

图5 红外吸收光谱图Fig.5 Infrared absorption spectrogram

图6 CCIC计算机拟合得到的构象图Fig.6 Computer fitting conformation

表7 分子拟合CCIC包合前后的能量变化Table 7 Energy changes of inclusive CCIC according to the molecular modeling

3 结 语

本实验通过预试验对饱和水溶液法、研磨法、超声法制备CCIC进行比较，得出研磨法制备的CCIC较其它两种方法制备的CCIC溶解度高，所以选用研磨法制备。HBCD水溶性较β-环糊精大[9]，通过预试验对HBCD和β-环糊精进行了考察，研磨法制备HBCD和β-环糊精包合物，HBCD包合物溶解度明显高于β-环糊精包合物。所以试验选择以HBCD为材料研磨法制备CCIC。

CCN在蒸馏水中的溶解度为4.5×10-5mg/mL，制备成包合物后CCN溶解度增大了3.82×104倍。由此可见将CCN制备成CCIC，可大大提高CCN在水溶液中的溶解度。

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