rL-RVG通过拮抗α7烟碱型乙酰胆碱受体影响胃癌细胞凋亡及增殖

尹超云，严玉兰，章安伟，张烜烽，步雪峰

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江212002；3.江苏大学附属人民医院呼吸内科，江苏 镇江212002）

乙酰胆碱受体在很多肿瘤细胞中高度表达，如非小细胞肺癌、胃癌、膀胱癌、大肠癌等[1]。研究发现α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR）的表达与激活对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移[2]，血管生成[3]和炎症反应[4]具有重要影响。尼古丁等药物可通过激活乙酰胆碱受体促进胃癌细胞增殖及转移[5]；5-氟尿嘧啶可抑制α7-nAChR表达，发挥抗肿瘤作用[6]。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是一种以感染禽类为特点的鸡瘟病毒[7]，属于禽副黏病毒科的副黏病毒Ⅰ型[8]。有研究发现NDV病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、狂犬病毒等多种病毒具有溶瘤作用[9－10]。烟碱型乙酰胆碱受体可与狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）结合[11]，且 RVG的 G蛋白具有与银环蛇毒相近的烟碱型乙酰胆碱受体阻断作用[12]。重组 LaSota株新城疫病毒（recombinant La-Sota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein，rL-RVG）可以稳定表达 RVG[13]，关于 rL-RVG是否可以通过拮抗乙酰胆碱途径影响胃癌HGC细胞凋亡及增殖尚不清楚。本实验采用rL-RVG感染HGC细胞，旨在探索细胞凋亡及增殖与乙酰胆碱途径之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基（Gibco公司），胎牛血清（HyClone公司）。人胃癌HGC细胞由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供，NDV病毒株及rLRVG病毒株由哈尔滨兽医研究所馈赠。Tris缓冲液（0.05 mol/L TBS，pH＝7.35，自制）；羊抗兔 α7-nAChR抗体（南京厚载公司）；羊抗兔pro-caspase 3抗体（ImmunoWay公司）。核荧光染料（Hoechst 33342），Triton X-100、MTT试剂盒（Sigma公司）。HRP标记羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（上海康为世纪公司）。α7-nAChR抑制剂甲基牛扁亭碱为Santa Cruz公司产品，α7-nAChR激动剂溴化乙酰胆碱（Sigma公司）；Alexa Flour 488标记羊抗鼠IgG、Cy3标记羊抗鼠IgG（美国KLP公司），DFC300 FX荧光显微镜（德国莱卡公司）。

1.2 细胞培养和病毒感染

将NDV、rL-RVG病毒原液用未加血清的1640培养基稀释1 000倍。用含10%灭活胎牛血清的1640培养基在37℃及5%CO2的饱和湿度下培养HGC细胞，每隔24 h更换含10%胎牛血清的培养基，当细胞在培养瓶中覆盖率达80%时进行传代培养。传3代后将细胞接种于6孔板中，待细胞达到50%～70%融合时，将其随机分为rL-RVG组、NDV组及PBS组，分别加入上述稀释的rL-RVG、NDV病毒液及PBS 2 mL，培养1 h，再更换含10%胎牛血清的培养基继续培养24 h。

1.3 MTT检测rL-RVG对HGC细胞增殖的影响

用无血清1640培养基分别将rL-RVG及NDV病毒原液稀释至以下浓度：10－1、10－2、10－3、10－4、10－5mmol/L。将HGC细胞接种于96孔板（5×104/mL），每孔100μL，培养过夜，次日换含20 mL/L胎牛血清的1640培养基，在rL-RVG组和NDV组分别加入病毒液，PBS组加入PBS；每组设5个平行孔，1640完全培养基为调零孔。培养24 h，每孔加入20 μLMTT，培养4 h，每孔加入150μL二甲基亚砜溶解，酶标仪490 nm测定光密度（D）值，实验重复3次，计算细胞活力值＝（实验组平均D值/对照组平均D值）×100%。

1.4 免疫荧光染色观察HGC细胞中α7-nAChR的表达

取rL-RVG、NDV、PBS 3组细胞，分别使用4%低聚甲醛在室温下固定20 min，PBS洗3次，PBS稀释的0.5%Triton X100室温下处理细胞30 min，PBS洗3遍，5%的BSA封闭1 h，加入PBS溶解的α7-nAChR抗体（1∶100），4℃孵育过夜。洗3次，5 min/次；Cy3标记的兔二抗（1∶200）染色1 h，PBS洗3次，5 min/次；Hoechst 33342染色细胞核 10 min，PBS洗3次后再置于荧光显微镜下观察。

1.5 rL-RVG感染后的细胞形态学变化

将HGC细胞接种至6孔板培养，分为rL-RVG＋α7-nAChR抑制剂组、NDV＋α7-nAChR抑制剂组、PBS＋α7-nAChR抑制剂组，rL-RVG组、NDV组、PBS组，rL-RVG＋α7-nAChR激动剂组、NDV＋α7-nAChR激动剂组、PBS＋α7-nAChR激动剂组。当细胞生长至50%～70%密度时，各抑制剂组加入10－3mmol/L的甲基牛扁亭碱预处理4 h，各激动剂组加入10－3mmol/L的溴化乙酰胆碱预处理4 h；弃培养基，PBS洗 2遍；然后 rL-RVG组、rL-RVG＋α7-nAChR抑制剂组、rL-RVG＋α7-nAChR激动剂组感染rL-RVG；NDV组、NDV＋α7-nAChR抑制剂组、NDV＋α7-nAChR激动剂组感染NDV，PBS组、PBS＋α7-nAChR抑制剂组、PBS＋α7-nAChR激动剂组直接用PBS处理。倒置显微镜下观察受病毒感染的细胞形态。

1.6 蛋白质印迹法检测 RVG、NDV、pro-caspase 3、bax、bcl-2、α7-nAChR蛋白的相对表达

将方法“1.2”及“1.5”中经过处理的 HGC细胞种植于6孔板上（5×104个/mL），培养24 h后提取细胞蛋白，后经SDS-PAGE转膜；5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入小鼠抗RVG抗体（1∶300）、鸡抗NDV抗体（1∶300）、羊抗兔 pro-caspase 3抗体（1∶1 000）、羊抗兔 α7-nAChR抗体（1∶500）、羊抗兔 bax抗体（1∶400）、羊抗兔 bcl-2抗体（1∶400）、羊抗鼠β-肌动蛋白抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜；TBST洗3次，加羊抗鼠或羊抗兔 HRP标记 IgG（1∶3 000）室温孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL发光剂发光显色，在Typhoon 9400扫描仪上扫描记录，用LANE.1D软件（北京赛制公司）进行条带灰度值结果分析。

1.7 统计学处理

应用GraphPad Prism 6软件进行数据处理，数据以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rL-RVG对 HGC细胞RVG、NDV、pro-caspase 3与α7-nAChR蛋白表达的影响

蛋白质印迹结果显示，与PBS组及NDV组比较，RVG蛋白在rL-RVG组中显著性表达（P均＜0.01）；与 PBS组比较，NDV、pro-caspase 3和 α7-nAChR蛋白在rL-RVG组及NDV组中的表达均明显升高（P均＜0.01）；rL-RVG组与NDV组NDV蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；rL-RVG组α7-nAChR、pro-caspase3蛋白表达明显高于NDV组（P均＜0.01）。见图1。

2.2 rL-RVG对HGC细胞增殖的影响

MTT检测结果显示，不同浓度NDV和rL-RVG作用HGC细胞24 h后，细胞活力值随浓度增加而降低。与PBS对照组相比，各稀释浓度rL-RVG及NDV对细胞的增殖均有明显抑制作用（P＜0.05）。见图2。

图1 HGC细胞感染rL-RVG后RVG、NDV、pro-caspase 3和α7-nAChR蛋白的表达

图2 不同浓度NDV、rL-RVG病毒对胃癌HGC细胞增殖的影响

2.3 rL-RVG感染后HGC细胞α7-nAChR蛋白的荧光表达

免疫荧光染色结果显示，rL-RVG组HGC细胞α7-nAChR的表达明显高于NDV组及PBS组，NDV组高于PBS组（图3）。

2.4 rL-RVG感染后细胞形态学的变化

各组细胞经相应处理24 h后倒置显微镜下可见，细胞逐渐由贴壁生长状态转为悬浮生长状态，细胞膜皱缩，凋亡增多。rL-RVG组较NDV明显；α7-nAChR抑制剂处理过的 NDV组、PBS组分别较NDV组、PBS组明显，但rL-RVG＋α7-nAChR抑制剂组与rL-RVG组差别不大；经α7-nAChR激动剂处理过的rL-RVG组、NDV组和PBS组分别较rL-RVG组、NDV组和PBS组细胞膜明显皱缩，凋亡状态明显减弱。见图4。

图3 rL-RVG感染后HGC细胞α7-nAChR蛋白表达（荧光显微镜×1 000）

2.5 rL-RVG感染后 HGC细胞 pro-caspase 3、bax、bcl-2的相对表达量

蛋白质印迹结果显示，rL-RVG组和NDV组pro-caspase 3、bax表达明显高于 PBS组（P均＜0.01）。

pro-caspase3、bax蛋白在 NDV＋α7-nAChR抑制剂组、PBS＋α7-nAChR抑制剂组分别较NDV组、PBS组明显提高（P均＜0.01），在 rL-RVG＋α7-nAChR抑制剂组与rL-RVG组间无明显差异（P＞0.05）；bcl-2蛋白在NDV＋α7-nAChR抑制剂组、PBS＋α7-nAChR抑制剂组表达量分别明显低于NDV组、PBS组（P均＜0.01），在rL-RVG＋α7-nAChR抑制剂组与rL-RVG组间无明显差异（P＞0.05）。

图4 rL-RVG感染后HGC细胞的形态学变化（倒置显微镜×1 000）

pro-caspase3、bax蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激动剂组表达显著低于rL-RVG组（P＜0.05或P＜0.01），而NDV＋α7-nAChR激动剂组的表达量明显低于NDV组（P均＜0.01）。bcl-2蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激动剂组表达显著低于rL-RVG组（P＜0.05），而 NDV＋α7-nAChR激动剂组的表达量明显高于NDV组（P＜0.01）。见图5。

3 讨论

胃癌细胞中广泛表达α7-nAChR，α7-nAChR参与肿瘤的侵袭、增殖和转移[4]。rL-RVG稳定表达的RVG可与烟碱型乙酰胆碱受体结合，对其具有阻断作用[11－13]，所以我们猜测rL-RVG可以通过拮抗α7-nAChR受体促进胃癌细胞凋亡及抑制胃癌细胞增殖。

本研究MTT试验显示，当病毒浓度接近于10－5mmol/L时，rL-RVG、NDV组的细胞活力明显受到抑制。同时免疫荧光及蛋白质印迹证实胃癌细胞稳定表达α7-nAChR，加入rL-RVG病毒后α7-nAChR蛋白表达明显提高。α7-nAChR表达升高应该会抑制肿瘤细胞凋亡[6]，但凋亡蛋白及光镜下形态学结果显示rL-RVG作用后HGC细胞凋亡增多。rL-RVG感染HGC细胞产生的RVG的G蛋白竞争性抑制了α7-nAChR，进一步促进HGC细胞凋亡，从α7-nAChR免疫荧光及蛋白质印迹可以看出，RVG的G蛋白对α7-nAChR有拮抗作用，引起α7-nAChR反馈性上调。而且蛋白质印迹结果显示，α7-nAChR抑制剂作用HGC细胞24 h后，pro-caspase 3及bax表达量与rL-RVG组无明显差异，说明rL-RVG本身产生的RVG产生同样的效果。但NDV及PBS组加入抑制剂后其表达量增多，证明了α7-nAChR抑制剂可以促进胃癌细胞凋亡，这与本课题组的前期实验相符[10]。

同时，α7-nAChR激动剂加入rL-RVG组和NDV组后pro-caspase 3及bax蛋白表达受到明显抑制，进一步证实rL-RVG感染HGC通过拮抗α7-nAChR途径促进胃癌细胞的凋亡和抑制其增殖。

本实验是对rL-RVG杀肿瘤作用理论的补充，为rL-RVG在临床上治疗肿瘤晚期患者提供了一定实验基础。关于rL-RVG通过烟碱型乙酰胆碱受体作用哪些途径导致HGC细胞凋亡还需进一步探索。

图5 rL-RVG感染后HGC细胞凋亡相关蛋白的表达

[1]Alexander DJ.Gordon Memorial Lecture.Newcastle disease[J].Br Poult Sci，2001，42（1）：5－22.

[2]Mayo MA.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol，2002，147（8）：1655－1663.

[3]Jin CY，Park C，Hwang HJ，et al.Naringenin up-regulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAIL-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res，2011，55（2）：300－309.

[4]Zhao J，Lu Y，Shen HM，et al.Targeting p53 as a therapeutic strategy in sensitizing TRAIL-induced apoptosis in cancer cells[J].Cancer Lett，2012，314（1）：8－23.

[5]Tu CC，Huang CY，Cheng WL，et al.Silencing A7-nAChR levels increases the sensitivity of gastric cancer cells to ixabepilone treatment[J].Tumour Biol，2016，37（7）：9493－9501.

[6]Dasgupta P，Rizwani W，Pillai S，et al.Nicotine induces cell proliferation，invasion and epithelial-mesenchymal transition in a variety of human cancer cell lines[J].Int JCancer，2009，124（1）：36－45.

[7]Heeschen C，Weis M，Aicher A，et al.A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors[J].JClin Invest，2002，110（4）：527－536.

[8]Pavlov VA，Wang H，Czura CJ，et al.The cholinergic anti-inflammatory pathway：a missing link in neuroimmunomodulation.[J].Mol Med，2003，9（5－8）：125－134.

[9]Ge J，Wang X，Tao L，et al.Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe，highly immunogenic，and provides long-lasting protection in dogs and cats[J].J Virol，2011，85（16）：8241－8252.

[10]赵英海，严玉兰，李米，等.重组新城疫病毒 rL-RVG诱导人胃腺癌细胞内质网应激和凋亡[J].江苏大学学报（医学版），2016，26（3）：199－203.

[11]Gastka M，Horvath J，Lentz TL.Rabies virus binding to the nicotinic acetylcholine receptorαsubunit demonstrated by virus overlay protein binding assay[J].J Gen Virol，1996，77（Pt10）：2437－2440.

[12]Mai H，MayWS，Gao F，etal.A functional role for nicotine in Bcl-2 phosphorylation and supression of apoptosis[J].JBiol Chem，2003，278（3）：1886－1891.

[13]Lentz TL，Burrage TG，Smith AL，et al.Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor？[J].Science，1982，215（4529）：182－184.