miR-136对胶质瘤U251细胞生物学功能的影响

钱尧，邵根宝，于强，陈波，王景文，李鲁博，周洲，王品昊，李巧玉

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.江苏大学附属人民医院神经外科，江苏镇江212002）

恶性胶质瘤恶性度高、侵袭性强，即使联合手术、放疗和化疗，也无法明显提高患者的生存率[1]。如常见的恶性星形细胞瘤，单纯手术治疗2年生存率为50%左右，中位生存期20～28个月[2]。微小RNA（miRNA）是一种内生的、非编码单链、小分子RNA[3]，其可与靶 基因 mRNA 3′-非翻译区 （3′-UTR）结合从而调控靶基因的表达；根据靶基因的种类，发挥类似癌基因或抑癌基因的功能，与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学过程密切相关[4－7]。miRNAs在多种肿瘤包括胶质瘤中均发挥调节作用，部分miRNAs在胶质瘤发生发展中的作用机制已阐明[8]。miR-136在卵巢癌、乳腺癌及肺癌等多种肿瘤中呈低表达[9－11]。另有研究证实，miR-136在人胶质瘤组织中也呈低表达[12－14]，其发挥的作用与不同类型的下游靶基因相关。FZD4属于frizzled家族，与恶性肿瘤关系密切，通过信号通路参与恶性肿瘤的一系列生物学行为，包括增殖、凋亡、侵袭和转移等[15]。但是，miR-136在胶质瘤中的作用及其是否参与对FZD4的调控尚不清楚。因此，本研究选择胶质瘤U251细胞系，上调miR-136的表达，分析FZD4的表达及其对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质瘤U251细胞系购自美国典型培养物保藏中心。DMEM、PBS、胰蛋白酶为美国 Hyclone公司产品。胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司。miR-136模拟物序列：5′-ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA-3′，阴性对照序列：5′-GUCCCACUUCGACCGUGCUUCCA-3′，由广州锐博生物有限公司构建。Lipofectamine2000转染试剂盒为美国Invitrogen公司产品；Trizol试剂盒、反转录试剂盒、定量PCR试剂盒、蛋白裂解液RIPA均为日本TaKaRa公司产品。CCK-8购自北京Sigma公司。FZD4兔抗人单克隆抗体、内参GAPDH抗体为美国Abcam公司产品。miR-136、FZD4及内参U6引物由上海生工生物工程有限公司合成。ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物试剂有限公司。

1.2 细胞培养

采用含有10%胎牛血清和1%青霉素及链霉素的DMEM高糖培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3 细胞转染

转染前1 d胰酶消化U251细胞并计数，接种于6孔板中，分为2组。当细胞密度接近90%时，利用Lipofectamine2000转染试剂分别转染miR-136模拟物（50 nmol/L，模拟物组）及 miR-136模拟物阴性对照（50 nmol/L，对照组）。转染后将细胞置于培养箱中培养48 h。

1.4 实时定量 PCR检测 U251细胞 miR-136和FZD4 mRNA的表达

取“1.3”转染后的2组细胞，参照Trizol试剂盒说明书分别提取细胞内总RNA，核酸测定仪检测RNA浓度及纯度[D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0之间]。将RNA反转录为cDNA，miR-136反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAT-3′。反应体系 10μL，反应条件：42℃60 min；70℃10 min，1个循环。取反转录产物行定量PCR，miR-136引物序列：上游5′-GCGCACTCCATTTGTTTTGAT-3′；下 游 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。FZD4引物序列：上游 5′-AAACTAGCGGCCGCTAGTTCAGTTACCAGTGACCTTCAT-3′；下游 5′-CTAGATGAAGGTCACTGGTAACTGAACTAGCGGCCGCTAGTTT-3′；以 U6为 内 参。PCR反应条件：反应体系20μL，90℃30 s；95℃5 s，60℃ 30 s，共 40个循环。以 2－ΔΔCt值计算 mRNA的相对表达量，实验重复3次。

1.5 细胞增殖实验

取“1.3”转染后2组细胞，胰酶消化，接种于6孔板中（细胞计数1×105个/孔），于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h；待细胞完全贴壁后显微镜下观察细胞密度，拍照记录，记为“0 h”，继续培养24 h，显微镜下观察并拍照记录，记为“24 h”。

取“1.3”转染后2组细胞，调整细胞密度为1×104个/孔，并接种于96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。连续培养72 h，每24 h加入10μL CCK-8试剂，于37℃、5%CO2培养箱培养2 h，测各组细胞在450 nm波长处的光密度（D）值。

1.6 Transwell和划痕实验

采用Transwell实验评估胶质瘤细胞的侵袭能力。取“1.3”转染后的2组U251细胞，胰酶消化、离心，弃上清液，重悬于无血清培养基中；再将细胞置于含有Matrigel侵袭室内，在下室中加入有血清的培养基，于培养箱中诱导培养；次日用4%低聚甲醛室温固定30 min；结晶紫染色15 min；弃小室内液体，用棉签轻轻擦干，并置于显微镜下拍照。

采用划痕实验评估胶质瘤细胞的迁移能力。将2组细胞接种于6孔板中，置于培养箱中培养。次日观察细胞，待铺满培养板后，用200μL枪头垂直画线，形成间隙。PBS重复洗3遍，再加入不含血清的培养基，放入培养箱中培养；分别于0 h、24 h显微镜下观察并拍照。

1.7 miR-136靶基因生物信息学预测

检索 miRnada[16]生物信息学数据库根据信息提示，预测并分析miR-136的下游靶基因。

1.8 蛋白质印迹法检测U251细胞中FZD4蛋白的表达

取“1.3”转染后2组细胞，按照RIPA说明书分别提取总蛋白；100℃水浴15min使蛋白充分变性；行SDS-PAGE，每孔上样量15μL；110 V电泳1 h；300 mA恒流，90 min转至PVDF膜；5%封闭液（2 g脱脂奶粉溶于40 mL TBST溶液）于4℃封闭4 h；TBST缓冲液摇床振荡洗膜3次，每次2 min；加入抗FZD4单抗及内参GAPDH抗体（均1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；次日TBST缓冲液摇床漂洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶1 000稀释）室温孵育1 h；TBST洗涤3次，每次10 min；将超敏ECL化学发光试剂盒A液和B液按1∶1混合，均匀加至PVDF膜，室温避光孵育2 min；置于自动显影仪器进行目的蛋白显影，采用Image J图像分析软件进行灰度分析。

1.9 统计学方法

每组实验独立重复3次，统计分析采用SPSS 17.0软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组间均数比较采用Student′st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-136的转染效率

qRT-PCR检测结果显示，模拟物组胶质瘤U251细胞中miR-136的表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（t＝10.05，P＜0.05）。见图1。

图1 U251细胞中m iR-136的表达

2.2 miR-136对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响

镜下观察结果显示，在0 h时模拟物组和对照组细胞密度无明显差异，转染24 h之后模拟物组细胞密度明显低于对照组，说明miR-136可抑制U251细胞生长。见图2。

图2 U251细胞的生长密度（×400）

CCK-8检测结果显示，在24，48，72 h时模拟物组D值均低于对照组（P＜0.05），尤其在24～48 h模拟物组细胞增殖非常缓慢，基本停止增殖，表明miR-136可抑制胶质瘤U251细胞的增殖活性。见图3。

图3 CCK-8检测U251细胞增殖力

Transwell实验结果显示，转染24 h后模拟物组U251细胞数明显少于对照组，说明miR-136可抑制U251细胞侵袭。见图4。

图4 Transwell实验检测细胞的侵袭能力（×200）

划痕实验结果显示，转染24 h后模拟物组U251细胞迁移距离明显小于对照组，表明miR-136可抑制U251细胞的迁移。见图5。

图5 划痕实验检测细胞的迁移能力（×40）

2.3 miR-136靶基因生物信息学预测

利用miRnada数据库分析miR-136的靶基因，结果发现FZD4可能是其下游靶基因。miR-136与FZD4 mRNA 3′-UTR结合区域预测结果见图6。

图6 靶基因数据库预测FZD4为m iR-136下游靶基因

2.4 转染后U251细胞中FZD4 mRNA和蛋白的表达

qRT-PCR结果显示，模拟物组中FZD4 mRNA表达水平明显低于对照组（t＝5.878，P＜0.05），说明miR-136抑制FZD4 mRNA表达。蛋白质印迹检测结果显示，模拟物组FZD4蛋白表达水平明显低于对照组（P＜0.05）。由此表明，miR-136抑制FZD4蛋白表达。见图7。

3 讨论

miRNA在大小、结构和功能方面存在着高度的保守性，组成了物种进化过程中细胞高度复杂的RNA表达调控网络[17]，参与细胞的分化、增殖、凋亡等一系列关键进程。邢亚楠等[18]报道证实，抑制miR-136表达可促进PPP2R2A蛋白表达，进而引起胃癌细胞凋亡。因此，miR-136功能失调可能导致恶性肿瘤的发生发展。本研究结果显示，上调miR-136表达可明显抑制U251细胞的生物学活性，从而证实miR-136在胶质瘤的发生发展进程中发挥着类似抑癌基因的功能。

图7 m iR-136转染后U251细胞FZD4 mRNA和蛋白的表达

FZD4是wnt信号通路中重要的下游基因，参与细胞的增殖、侵袭及凋亡等多种生物学过程[19]。据文献报道，FZD4参与多种恶性肿瘤细胞内的信号传导，在肿瘤细胞中发挥着类似癌基因的作用，如在膀胱癌、肺癌及宫颈癌等癌组织中均呈高表达，且其高表达水平与肿瘤的预后不良密切相关[16，20－21]。本研究通过miRnada生物信息学数据库预测FZD4 mRNA 3′-UTR存在miR-136的靶向结合位点。因此，我们推测FZD4可能为miR-136的靶基因之一，miR-136与FZD4之间可能存在靶向调控作用。本研究结果显示，上调miR-136可明显降低FZD4 mRNA及蛋白表达，因此证实 miR-136可负向调控FZD4的表达，从而抑制胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及转移。但是本研究只证实上调miR-136可抑制FZD4的表达，尚未阐述miR-136靶向调控FZD4的具体作用机制，以及FZD4是否参与胶质瘤发生发展的其他过程（如U251细胞凋亡）与预后的关系等，还需要进一步研究。

综上所述，在胶质瘤U251细胞中miR-136可能通过下调FZD4的表达，进而抑制细胞的增殖、侵袭及迁移，提示miR-136、FZD4可作为临床治疗胶质瘤的潜在标志物。

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