微囊化JS25噬菌体在液态食品中的释放规律及生物防制效果

龙 门 ，孙梦媛 ，谢 文 ，周 卉 ，王 冉

（1. 江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室，南京 210014；2. 滁州学院生物与食品工程学院，安徽省热敏性物料加工工程技术中心，滁州 239000）

0 引 言

噬菌体广泛存在于自然界中（水、土壤、空气），烈性噬菌体可感染或裂解细菌，目前已经广泛应用在对人类细菌感染的治疗方面[1-2]。近年来，噬菌体杀菌已经取得了重大的突破，表现为弯曲杆菌[3]，大肠杆菌[4]，肠杆菌[5]，假单胞菌[6]，热死环丝菌[7]，沙门菌[8]和李斯特菌[9]等均有大量研究。从食品安全的角度来说，噬菌体是预防和控制一些不需要的细菌，而不干扰自然生物群落细菌的最佳方式[10-11]。噬菌体无毒，不仅可以提高食品的安全性，而且也不会改变食物的色、香、味[12]，在温度低至1℃时仍然能够裂解宿主细胞，可抑制冷藏食品中细菌（特别是嗜冷菌）的生长，并且一旦食品取出置于室温条件下，噬菌体便可进一步控制其增殖。JS25噬菌体从牛奶场污水中分离，属于肌尾噬菌体科噬菌体，具有极强的细菌裂解能力，可以较好的感染并杀死宿主细胞[13]；该类噬菌体在应用至食品杀菌中的优势表现在，噬菌体没有遗传功能，并且不能转录细菌DNA，主要是通过感染杀死宿主细胞[14]。

虽然噬菌体具有巨大的应用优势，并且已经取得了广泛的应用，但是由于其保存时间相对较短的特点也限制了在食品、医药领域中的应用范围。研究表明，浮游状态的噬菌体稳定性极差，在室温条件下贮藏6～12 h后即失活，严重制约了其应用范围[15-16]。微囊化技术是一种常用的活性物质包埋技术，该技术不但可以通过包埋法固定活性物质以提高其稳定性，还可以通过包埋技术调控活性物质的释放速率，以增加活性物质的应用可能性[15-16]。目前已经在功能性油脂、益生菌等医药、食品包装、生物技术、环境保护领域取得了重大的研究成果[17-20]。但是该技术在针对JS25噬菌体的微囊化及其结构表征的研究应用还未见报道。因此，本试验通过海藻酸钠微囊化JS25噬菌体，并对制备的JS25噬菌体微囊粉进行结构及稳定性进行表征，通过分析JS25噬菌体微囊粉在不同液态食品中的释放规律、稳定性及对液态食品的生物防制作用确定其抑菌保鲜功效，以期为液态食品提供一种适用的非热杀菌新技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂

vB_SauM_JS25噬菌体（以下简称JS25噬菌体）由江苏省农科院食品质量安全与检测研究所提供，分离自奶牛场污水；金黄色葡萄球菌 ATCC6538购自北京陆桥技术有限公司；鲜牛奶购自南京卫岗乳业有限公司；鸡蛋清分离自新鲜鸡蛋，购自农贸市场；营养肉汤购自安徽绿源生物科技有限公司；营养琼脂、营养肉汤培养基（lysogeny broth，LB）、Baird-Parker培养基购自青岛新希望生物科技有限公司；MgSO4、CaCl2、柠檬酸钠、碳酸氢钠、海藻酸钠、盐酸等所有生化试剂均购自国药集团试剂有限公司，分析纯。

1.1.2 仪器设备

LRH-250A生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；TXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FA2204B 电子天平，上海越平科学仪器有限公司；R-134A型恒温振荡摇床，美国热电公司；JL-1166型激光粒度分布测试仪，成都精新粉体测试设备有限公司；JSM-6510扫描电镜，日本电子株式会社。

1.2 试验方法

1.2.1 JS25噬菌体微囊粉的制备表征

1）溶液配制[21-22]

① SM缓冲液：称取硫酸镁2 g，明胶0.1 g，氯化钠5.8 g，溶解于900 mL去离子水中，再加入50 mL、1 mol/L的Tris-HCl溶液，去离子水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min，置于4 ℃冰箱中保存备用。

② 微球破解液（mierosphere-brokensolution，MB）：称取柠檬酸钠14.7 g，碳酸氢钠16.8 g，溶于1L的SM缓冲液中，0.22 μm滤膜过滤除菌，常温保存备用。

2）海藻酸钠微囊化JS25噬菌体制备流程[23-24]

① 将4 ℃保存的金黄色葡萄球菌噬菌体JS25采用液体增值法扩增培养至1011PFU/g（浮游态JS25噬菌体）。

② 将3.5 g海藻酸钠溶解于100 mL、50 mmol/L Tris-HCl溶液中（pH值=7.5），然后加入噬菌体悬液，搅拌混匀，噬菌体终浓度分别为 108、109、1010、1011、1012PFU/g，真空脱气除去溶液中气泡。③ 将上述溶液用2 mL无菌注射器逐滴滴入100 mL，质量分数为2.5%CaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶，（20± 2）℃静置硬化30 min。④ 过滤收集微球，用去离子水洗涤后，冷冻干燥（将制备好的微球放入冰箱内进行预冻结, 温度-20℃，冷冻时间 24 h；其后进行冷冻干燥，冷冻干燥机的冷阱温度为 -50 ℃，干燥室压力 60 Pa,干燥8 h）制备微囊粉，备用。

3）JS25噬菌体微囊粉的表征

针对上述试验制备的JS25噬菌体微囊粉，分析其粒径分布情况及扫描电镜结果。

4）JS25噬菌体微囊粉的稳定性分析

以浮游态JS25噬菌体为对照，分别分析在微囊化前后JS25噬菌体在4 ℃及20 ℃贮藏0、0.25、0.5、1、7、14、21、28、35 d过程中的效价变化。

1.2.2 JS25噬菌体微囊粉在液态食品中的释放及稳定性

1）JS25噬菌体微囊粉在液态食品中释放规律

将JS25噬菌体微囊粉按照添加量为1.0 g/kg分别添加至鲜牛奶、蛋清液、肉汤 3种液态食品中，并于震荡混合1、5、10、15、20、25、30、60 min时确定不同食品中噬菌体的效价，并以 MB为对照，确定不同液态食品中噬菌体微囊粉的释放率。

2）JS25噬菌体微囊粉在液态食品中稳定性

将JS25噬菌体微囊粉按照添加量为1 g/kg分别添加至鲜牛奶、蛋清液、肉汤 3种液态食品中，分别于震荡混合0.25（6 h）、1、2、3、6、9、12 d时检测不同食品中噬菌体效价，以浮游态JS25噬菌体为对照。

1.2.3 JS25噬菌体微囊粉对液态食品中致病菌的生物防制作用

1）液态食品样品处理方法

分别取鲜牛奶、蛋清液、肉汤3种液态食品10 g于无菌取样瓶中，4 ℃冷藏备用。将金黄色葡萄球菌37 ℃培养至对数期，用缓冲液稀释金黄色葡萄球菌浓度至2×103CFU/mL，按照1∶1（体积比）添加至上述液态食品中，混合均匀后，使菌落数为103CFU/g。

2）JS25噬菌体微囊粉对液态食品中致病菌的生物防制作用

将JS25噬菌体微囊粉分别按照质量比为0、0.1、0.5、1.0、2.0 g/kg添加至上述的液态食品中。上述不同处理的液态食品混匀后分别贮藏于4及20 ℃中，于第0、0.25（6 h）、1、2、3、6、9、12 d时检测食品中金黄色葡萄球菌的数量。

1.2.4 方法测定

JS25噬菌体效价测定：首先将金黄色葡萄球菌宿主菌培养至对数期备用。将纯化好的噬菌体 VB_SauM_JS25用SM缓冲液梯度稀释，取合适倍数的稀释液0.1 mL和对数期金黄色葡萄球菌菌体于5 mL半固体培养基中混匀后预先准备好的固体平板上。制成双层平板，等平板凝固后倒置，放在37 ℃培养箱里面培养24 h，第2天观察噬菌斑的个数。噬菌体的效价（PFU/mL）=噬菌斑数目×稀释倍数。

包埋率测定：取5 g微囊粉成品加入15 mL SM缓冲液中 37 ℃水化 15 min，然后将水化后的微囊粉加入45 mL MB中，20 ℃溶解1 h后，检测破解液中噬菌体效价。包埋率为微囊粉中JS25噬菌体效价与初始噬菌体效价之比（%）。

释放率测定[25]：释放率的计算方式为JS25噬菌体微囊粉在不同液体中的噬菌体效价与在破解液中的效价之比具体见公式（1）。

其中M1为JS25噬菌体微囊粉在不同液态食品中的效价；M2为JS25噬菌体在MB中噬菌体的效价。

粒径测定[26]：采用马尔文纳米粒度基于动态光散射原理测定仪测定JS25噬菌体微囊粉的平均粒径。

扫描电镜：取适量JS25噬菌体微囊粉，将其用胶粘附于铝制的样品载物台上，再放入真空喷涂仪内进行蒸镀Au/Pd，最终于JSM-6510扫描电镜下观察形态。

1.2.5 数据统计分析

所有数据利用Microsoft Excel 2010进行统计处理，用SAS 9.2进行ANOVA分析，不同平均值之间利用LSD法进行差异显著性检验（X±SD，n=3）。

2 结果与分析

2.1 JS25噬菌体微囊粉制备及结构表征

2.1.1 JS25噬菌体微囊粉制备

表1为不同初始噬菌体效价时，JS25噬菌体微囊粉的包埋率。从图中可以看出，当JS25噬菌体微囊粉的效价超过 1010PFU/g时，微囊粉中噬菌体包埋率显著（P＜0.05）增加。为了提高JS25噬菌体微囊粉的包埋率及被包埋的 JS25噬菌体效价，本研究选对效价为 12 lg（PFU/g）的初始噬菌体进行包埋，得到微囊粉中噬菌体效价为11.94 lg（PFU/g），包埋率为87.4%。

表1 JS25噬菌体微囊粉制备Table 1 preparation of JS25 phage microencapsulated powder

2.1.2 JS25噬菌体微囊粉结构表征

1）扫描电镜结果

为了表征JS25噬菌体的颗粒形态，通过扫描电镜对JS25噬菌体微囊粉（图1b）及海藻酸钠凝胶（图1a）进行表征后可以看出，微囊粉呈均匀的颗粒状分布，而海藻酸钠胶体大致呈网状、块状结构。

图1 扫描电镜结果（放大倍数×5000）Fig.1 Scanning electron microscopy results(magnification times×5000)

2）JS25噬菌体微囊粉粒径分布

对试验得到的JS25噬菌体微囊粉进行粒径分析后可以看出，微囊粉粒径范围在20～90μm之间，且呈正态分布。其中粒径范围在30～50μm之间的微囊粉约占比60%；说明试验中得到的JS25噬菌体微囊粉颗粒均匀，该工艺能有效、均匀的完成对噬菌体的包埋。

2.2 JS25噬菌体微囊粉的稳定性结果

图3为不同温度条件下JS25噬菌体微囊粉的稳定性结果。从图中可以看出，在 4 ℃时，浮游态噬菌体在贮藏1 d时，效价从9.0 lg（PFU/mg）迅速至0。而JS25噬菌体微囊粉在贮藏35 d后，效价呈轻微的降低。在20℃时，浮游态噬菌体在6 h后即失活至0，而噬菌体微囊粉在1 d后呈略微的降低，在贮藏35 d后，效价从8.94 lg（PFU/mg）降低至 7.54 lg（PFU/mg）（P＜0.05），仅下降1.4 lg（PFU/mg）。

图2 JS25噬菌体微囊粉粒径分布Fig.2 JS25 phage particle size distribution

图3 JS25噬菌体微囊粉稳定性结果Fig.3 JS25 phage microcapsules stability results

2.3 JS25噬菌体微囊粉在液态食品中释放规律

JS25噬菌体在不同食品模拟体系中的释放规律见图4。从图中可以看出，在不同种类的液态食品体系中，JS25噬菌体具有相似的释放规律，均表现为在0～30 min快速释放，在30 min时释放率均超过90%。另外，对比不同食品中噬菌体的释放速率可以看出，JS25噬菌体微囊粉在鲜牛奶中的释放速率最高，在20 min后释放率可达到80%以上，其次为肉汤，在20 min释放率可达到83.89%；JS25噬菌体微囊粉在蛋清液中的释放速率相对较低，表现为在20 min后释放率仅为73.22%。因此可以看出，微囊粉状的JS25噬菌体在不同的液态食品中均能有效的释放，可以用于液态食品的生物防制中。

图4 JS25噬菌体微囊粉在液态食品中的释放规律Fig.4 JS25 phage microcapsules release curve in liquid food

2.4 JS25噬菌体微囊粉在液态食品中稳定性结果

为了进一步验证JS25噬菌体微囊粉在不同液态食品中的应用可行性，通过检测在不同的贮藏温度及贮藏过程中，JS25噬菌体在液态食品中的效价结果见图 5。从图中可以看出，在4 ℃及20 ℃贮藏过程中，JS25噬菌体在鲜牛奶及肉汤中效价均有轻微的增长，但是无显著差异（P＞0.05）；即JS25噬菌体在牛奶及肉汤中具有极高的稳定性。另外，JS25噬菌体在蛋清液中的稳定性结果可以看出，在4 ℃及20 ℃贮藏过程中，JS25噬菌体效价显著（P＜0.05）降低，表现为在贮藏12d后噬菌体效价分别降低1.10及1.60 lg（PFU/mg）。综合试验结果可以看出，在4及20 ℃的贮藏过程中，JS25噬菌体在液态食品中均有较高的稳定性。

图5 JS25噬菌体微囊粉在液态食品中的稳定性Fig.5 JS25 phage microcapsules stability in liquid food

2.5 JS25噬菌体微囊粉对液态食品中生物防制作用

2.5.1 JS25噬菌体微囊粉对鲜牛奶中致病菌生物防制效果

不同添加量的JS25噬菌体微囊粉对鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的生物防制作用结果见图6。从图中可以看出，不同量的JS25噬菌体对鲜牛奶中的金黄色葡萄球菌均有极强的抑制作用，具体表现在不同温度条件下（4或 20℃），当JS25噬菌体微囊粉添加量为0.1 g/kg时，随着鲜牛奶贮藏时间的延长，牛奶中金黄色葡萄球菌总数急剧下降，当贮藏时间为3 d时，金黄色葡萄球菌数量降低至0.1 lg（CFU/g）左右，随着贮藏时间继续延长至6 d，菌落数降低至 0；并且随着 JS25噬菌体添加量增加至0.5 g/kg，牛奶中金黄色葡萄球菌总数在贮藏3 d时降低至0；当JS25噬菌体微囊粉继续增加至0.5 g/kg时，不同温度条件下下鲜牛奶中金黄色葡萄球菌迅速降低至0。

2.5.2 JS25噬菌体微囊粉对蛋清液中致病菌生物防制效果

图7为不同JS25噬菌体微囊粉对蛋清液的生物防制作用结果。从图中可以看出，不同温条件下，随着 JS25噬菌体微囊粉添加量的增加，对蛋清液中的生物防制作用不断加强，具体表现为在JS25噬菌体微囊粉添加量为0.1 g/kg时，不同温度条件下菌落总数在贮藏3～12 d时不断增加，在贮藏12 d时，4 ℃及20 ℃蛋清液中的菌落数分别为5.44及6.89 lg（CFU/g）；随着JS25噬菌体微囊粉添加量增加至0.5 g/kg，4 ℃贮藏0～12 d时，蛋清液菌落数持续降低至1.21 lg（CFU/g），但是在20 ℃贮藏条件下，蛋清液中的菌落数增长至3.22 lg（CFU/g）；当JS25噬菌体微囊粉添加量增加至1.0 g/kg时，噬菌体对蛋清液的生物防制作用显著（P＜0.05）提高，表现为在贮藏0～6 d，金黄色葡萄球菌数急剧减少，在4 ℃及20 ℃贮藏6 d菌落数降低至0。

图6 JS25噬菌体微囊粉对鲜牛奶金黄色葡萄球菌抑制作用Fig.6 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in fresh milk

图7 JS25噬菌体微囊粉对蛋清液金黄色葡萄球菌抑制作用Fig.7 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in liquid egg white

2.5.3 JS25噬菌体微囊粉对肉汤中致病菌生物防制效果

JS25噬菌体对肉汤中的生物防制作用结果与蛋清液中的趋势相似，均表现为随着JS25噬菌体微囊粉添加量的增加，食品中的菌落总数显著降低，具体见图8。从图中可以看出，在不同温度的贮藏过程中，JS25噬菌体微囊粉在添加量为2.0 g/kg时，肉汤中的金黄色葡萄球菌数在贮藏4～6 d降低至0；当添加量低于1.0 g/kg时，肉汤中在贮藏过程中的菌落数相对较高。

图8 JS25噬菌体微囊粉对肉汤金黄色葡萄球菌抑制作用Fig.8 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in broth

3 讨 论

3.1 JS25噬菌体微囊粉稳定性

JS25噬菌体作为一种天然的杀菌剂广泛应用到食品保鲜中，以增强食品的安全性和延长食品的保质期，但是天然噬菌体大多为浮游态，极易失活，从而限制了其在食品保鲜加工中的应用[27-28]。从试验扫描结果可以看出，通过海藻酸钠-CaCl2体系可以将噬菌体包埋为微米级别的微囊粉，但是微囊粉呈不规则的圆球状，可能是因为海藻酸钠在挤出阶段或在 CaCl2溶液中硬化过程中导致，但是也有研究报道可能是由于噬菌体表面和海藻酸钠之间的相互作用导致[29]。另外，从试验结果可以看出，在20 ℃条件下，浮游态噬菌体在6 h即失活，而微囊粉态噬菌体在贮藏35 d仅失活15.66%，说明微囊粉能有效实现对JS25噬菌体的包埋。

3.2 JS25噬菌体生物防制作用

释放性能是载药微囊粉的重要性能指标，既可以保持活性物质在体系中不断释放，也可以提高活性物质的稳定性，从而达到长效作用。但是，从图5中可以看出，JS25噬菌体微囊粉在不同液态食品中的释放速率存在差异，可能是由于液态食品中的水分活度及流动性不同导致，这也是JS25噬菌体在不同液态食品中表现出不同稳定性的原因。Polk[30]通过对壳聚糖-海藻酸钠微胶囊中白蛋白的释放规律发现，不同溶液中水分活度越高、离子强度越低，微囊粉中的活性物质具有越快的释放速率。

试验结果表明，JS25噬菌体在液态食品中的防制作用主要依赖于噬菌体的效价，对比不同食品在贮藏过程中的金黄色葡萄球菌总数得到，JS25噬菌体微囊粉在鲜牛奶、蛋清液及肉汤中的添加量分别为0.1 g/kg、1.0 g/kg及2.0 g/kg时，对食品中的微生物有较强的抑制作用。因此可以看出，JS25噬菌体微囊粉对金黄色葡萄球菌的抑制效果会因食品种类的不同而存在差别，与 Guenther[31]的研究结果相似。主要原因可能是食品本身的性质（pH值、离子强度及水分活度）及噬菌体效价导致的[31]。

4 结 论

1）海藻酸钠和CaCl2组成的体系能有效地完成对初始效价为11.94 lg（PFU/g）的JS25噬菌体的包埋，并且试验中得到的JS25噬菌体微囊粉有稳定的颗粒结构，其颗粒粒径在20～90 μm之间呈正态分布，且噬菌体包埋率为87.4%。另外，该状态的噬菌体稳定性显著增加，表现为与浮游态噬菌体失活相比，4 ℃及20 ℃条件下噬菌体贮藏35 d也有较高的效价。

2）微囊粉状的 JS25噬菌体在不同的液态食品中均能有效的释放， 均表现为在0～30 min快速释放，在30 min时释放率均超过90%，并且在4 ℃及20 ℃的贮藏过程中，JS25噬菌体在液态食品中稳定性显著增加（P＜0.05）。

3）JS25噬菌体微囊粉对不同液态食品的生物防制结果表明，当S25噬菌体微囊粉添加量超过0.1、1.0、2.0 g/kg时，分别对鲜牛奶、蛋清液及肉汤中的致病菌有较强的清除作用。

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