荞麦生物活性肽的研究进展

李 蒙

(西安文理学院 生物与环境工程学院,陕西 西安 710065)

荞麦广泛分布于中国山区,特别是西南地区,包括四川、贵州等地,除此以外,在俄罗斯、日本等国家也广泛种植,常见的品种是甜荞和苦荞。荞麦种子含有多种生物活性成分,如丰富的蛋白质、黄酮化合物、肌醇等,荞麦蛋白在某种程度上与鸡蛋、牛奶中的蛋白功能相近[1],且其组成蛋白质的氨基酸种类全面，配比得当,含有大量的赖氨酸、精氨酸和其它必需氨基酸,因此,具有营养价值的荞麦蛋白被用于弥补谷类和蔬菜类蛋白的紧缺[2]。

荞麦具有很多重要的生物活性物质,已研究表明其对多种慢性病有很好的疗效,如高血压、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症和便秘[3]。生物活性肽是具有生物学活性的数个氨基酸组成的多肽,具有不同的生理学功能[4]。深入研究具有特殊生物活性的荞麦小分子活性肽,对于荞麦蛋白资源的开发利用具有重要的意义[5]。

1 荞麦中胰蛋白酶抑制剂

在过去的几十年里,从荞麦种子中分离出了多种蛋白酶抑制剂,然后根据氨基酸序列和酶活性特征被划分为不同类,它们在中性和酸性条件下普遍具有热稳定性。最开始人们将苦荞胰蛋白酶抑制剂分为永久性和短暂性两种[6-7],永久性胰蛋白酶抑制剂的特征是序列N端以亮氨酸为起始,由51～67个氨基酸组成;短暂性胰蛋白酶抑制剂的特征是序列N端以丝氨酸为起始,由85～99个氨基酸组成,比如荞麦蛋白酶抑制剂BWI-1(LRQCSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLRCDRVWVFV DERGVVVDTPVVM)和BTI-1(LRQSCGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLLCD RVDVFVDERGVVVDTPVVM)为永久性抑制剂[8-9],蛋白酶抑制剂BWI-2a(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDDFQRQQRGGGGSSD)和BWI-2b(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDD FQRQQRGGGGSSDEGN)为短暂性抑制剂[5]。后来学者们发现了由41个氨基酸组成的胰蛋白酶抑制剂BWI-2c(SEKPQQELEECQNVCRMKRWSTEMVHRCEK KCEEKFERQQR)[10],由4个半胱氨酸形成分子内二硫键。相关结构研究表明,半胱氨酸的数目和二硫键的形成是荞麦蛋白酶抑制剂的三维立体结构所必需的；之后发现的BWI-4a抑制剂有两种异构酶(序列1:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLP EGSAVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM和序列2:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAI VLPEGSGVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM),它们之间的差别是第40位氨基酸的种类(丙氨酸和甘氨酸)[11]。以上所有的胰蛋白酶抑制剂都是在甜荞中发现的,而从苦荞种子中分离的FtTI(LIYAKVKCLITGVRTYVGKQSWPELVGTKGKTAAATIDKENAHV TAVLCPPLTTLATCRTFDFRCDRVRVLINRIGGVVTKT PTVG)蛋白酶抑制剂是由86个氨基酸组成的[12]。

相关生理活性研究表明，荞麦蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,而对胰凝乳蛋白酶的作用效果不显著。离子交换色谱分析表明,蛋白酶抑制剂可以划分为阴离子和阳离子抑制剂,如荞麦中的BWI-1、BTI-1和BWI-4a属于阴离子抑制剂,而其它植物和细菌中的BWI-4c(GRGCQGLQEEPELVGTRGPA)属于阳离子抑制剂[13]。除了抑制酶活性外,蛋白酶抑制剂还具有抗菌性,荞麦蛋白酶抑制剂已被证实具有抑制HIV-1反转录酶活性和多种癌细胞增殖的作用[14]。荞麦作为功能性粮食作物,一直得不到广泛的开发利用,主要在于其产品口味一般以及蛋白质的低消化率,这种低消化率是由于荞麦中胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白酶抑制剂影响的结果。

2 荞麦中抗菌肽

荞麦在生长中会面临许多不利的环境,例如低温、干旱和病菌感染等,经过长期的进化,荞麦已具备抵抗害虫和病菌侵染与损伤的活性物质。研究发现从荞麦种子、麸皮和外壳分离的抗菌肽具有对多种致病菌的抗菌作用[15]。

植物防御素一般由45～54个氨基酸组成,结构中含有由8个半胱氨酸组成的4个二硫键[16]。目前,已经从小麦、大麦和其它植物中分离与鉴定出多种防御素,其结构与动物、人类防御素的结构有相似性[8]。人们从甜荞中分离出两种抗细菌肽Fa-AMP1(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCK)和Fa-AMP2(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQW GWCGSTPKYCGAGCQSNCK),它们由40个氨基酸组成,分子内有4个二硫键结构[17]。抗菌活性分析表明Fa-AMP1和Fa-AMP2可以抑制真菌和细菌的生长[14]。抗菌活性实验表明荞麦胰蛋白酶抑制剂BWI-2c具有抵抗微生物感染的功能[10]。还有从苦荞种子中分离的FtTI抗菌肽,其由86个氨基酸组成,分子量为14 kDa,含有两个二硫键,活性分析表明FtTl在浓度为30 μg/mL时可以完全抑制植物病原真菌(Mycosphaerellamelonis、Alternariacucumerina、Alternariasolani、Phytophthracapsici和Colletotrichumglaeosporioides)的生长[12]。还有蛋白酶抑制剂家族中的BWI-1同样可以抑制真菌(Alternariaalternata和Fusariumoxysporummycelia)的生长[18]。将BWI-1基因转入烟草和马铃薯中,发现能抑制Pseudomonassyringaepv.tomato和Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis[19]。

3 荞麦蛋白质对高胆固醇和肥胖的疗效

组成荞麦蛋白质的独特氨基酸序列能降低小鼠血浆胆固醇,对高胆固醇血症有治疗作用[20]。当未经消化的荞麦蛋白进入胃肠道后,会引起中性固醇的大量流失,扰乱肝肠循环,降低肝胆固醇浓度[21]。通过用荞麦蛋白喂养仓鼠,刺激胆汁的合成和排出更多酸性和中性类固醇,可以防止胆结石的形成[22]。研究发现从苦荞粉碎物中得到的TBP能减少大鼠血清胆固醇，下调NPC1L1和胆固醇乙酰转移酶活性,影响胆固醇的吸收[23-24]。

与其它动植物蛋白质(如动物酪蛋白和大豆蛋白)相比,提取的荞麦蛋白不但能更有效地降低血液中LDL、VLDL和胆固醇的含量,而且能降低肝脂肪生成酶的活性,例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和脂肪酸合成酶；此外，荞麦蛋白在其消耗过程中能降低肝脏与血浆中三酰甘油浓度，减少脂肪垫湿重[25-26]。

4 荞麦蛋白质的降血糖作用

调查表明食用荞麦能降低高血压、血脂紊乱和高血糖的发病率[27]。在荞麦中抗糖尿病的化合物主要为肌醇、黄酮和蛋白质,黄酮化合物中的芦丁、槲皮素和其它黄酮类化合物能对氧化应激和脂类代谢规律进行调节[28-30]。活性氧(ROS)会损伤胰岛细胞膜，引起糖尿病；而摄入荞麦蛋白后被证明通过增加抗氧化酶活性和消除ROS来治疗糖尿症[31-32]。荞麦幼芽的抗氧化活性能抑制炎症的发生和改变糖尿症患者的葡萄糖耐受性[33-34],通过酶解将荞麦蛋白质裂解成多肽,增加了清除自由基活性和铁离子螯合活性[35]。从消化后的荞麦蛋白质中获得4种抗氧化多肽,分别被命名为WPL、VPW、VFPW和PW,它们比经胃蛋白酶和胰酶消化后的荞麦蛋白质混合物具有更强的清除自由基的能力[36]。因此,探究荞麦蛋白质或多肽对脂质过氧化作用和糖尿病的治疗作用具有重要的意义,可以作为治疗它们的有利候选药物。

5 荞麦的降压肽

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)在高血压调节过程中起到重要作用,其中血管紧张素Ⅱ是主要的效应肽,而血管紧张素转化酶(ACE,EC3.4.15.1)催化血管紧张素Ι转化为血管紧张素Ⅱ,引起血压增加[37]。从荞麦中获得的多种小分子多肽能抑制血管紧张素转化酶的活性,这些小分子多肽主要由2～5个氨基酸组成。早期人们就从水解后的苦荞蛋白质中分离到了11种抑制肽,分别为FY(Val-Lys)、FY(Phe-Tyr)、AY(Ala-Tyr)、LF(Leu-Phe)、YV(Tyr-Val)、YQ(Tyr-Gln)、YQY(Tyr-Gln-Tyr)、PSY(Pro-Ser-Tyr)、LGI(Leu-Gly-Ile)、ITF(Ile-Thr-Phe)、INSQ(Ile-Asn-Ser-Gln),其中AY、FY、LF和YV与先前报道的ACE活性抑制肽序列一致[38],之后从发酵的荞麦芽中纯化出6种降压肽,分别为DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、FQ(Phe-Gln)、VAE(Val-Ala-Glu)、VVG(Val-Val-Gly)和WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg),这些天然多肽对自发性高血压大鼠具有降压作用[39]。研究发现多肽中的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸与血管紧张素转化酶的活性中心相结合,通过此方式产生抑制活性作用[40]。而荞麦降压肽几乎都具有相似的结构,C端都是酪氨酸,例如FY、AY、YQY、PSY和DVWY,然而GPP(Gly-Pro-Pro)的C端氨基酸是脯氨酸,因此,酪氨酸和脯氨酸对ACE的抑制作用很重要[41]。

6 荞麦抗癌蛋白质

早期发现BWI-1和BWI-2a对人的T-All细胞系(JURKAT和CCRF-CEM)具有抑制活性,其引发肿瘤细胞凋亡的机理与细胞DNA的变性或破碎有关[42]。从苦荞中克隆得到胰蛋白酶抑制剂基因,经表达获得具有活性的重组胰蛋白酶抑制剂(rBTI),通过上调Bax和Bak、下调Bcl-2和Bcl-xl，经线粒体凋亡通路诱导EC9706、HepG2和HeLa细胞凋亡[43]。通过噻唑比色法和血细胞计数分析,发现rBTI能抑制IM-9细胞和HL-60细胞的增殖[44]；经rBTI晶体结构分析,发现酪蛋白酶抑制剂的作用机理与其分子构象变化有关[45]。因此,通过内吞作用和膜电位变化,rBTI能进入HepG2细胞[46]。

研究表明荞麦蛋白经消化可阻碍二甲基苯丙蒽诱导性乳腺肿瘤的发生[47],荞麦蛋白类产品也已经被证明通过降低c-myc和c-fos蛋白的表达,抑制大鼠大肠癌的发生和抑制细胞增殖[48]。还有学者发现了一种分子量为57 kDa的水溶性荞麦蛋白,命名为TBWSP31[49]；其具有抑制人类乳腺癌细胞系生长的作用；进一步研究揭示，通过上调Fas和下调bcl-2,TBWSP31能诱导Bcap37细胞的凋亡[50-51]。因此,荞麦蛋白质的抗癌作用有待进一步发掘。

7 讨论

国内外对荞麦蛋白活性肽的制备、纯化、结构鉴定和生物活性的研究取得了很大进展,特别是荞麦的胰蛋白酶抑制剂具有开发成医药制剂的潜在价值；同时,荞麦蛋白和其水解的活性肽的降压作用和降血脂特性已成为现在研究的热点,所以,荞麦蛋白质可以被作为功能型食品添加剂,治疗心血管系统疾病。然而,吞食后的荞麦蛋白在胃肠道的消化与降解条件目前还不是很清楚,因此,深入研究荞麦蛋白的水解特性,发掘水解产物中具有特殊生物活性的小分子多肽,对有效利用荞麦蛋白资源具有重要意义。