泽兰实蝇幼虫内生细菌的分离鉴定及除草活性研究

兰明先,张 某,李建一,鲁武锋,李召波,夏 涛,李丽芳,吴国星,高 熹

(云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201)

紫茎泽兰EupatoriumadenophorumSpreng属菊科泽兰属,为多年生恶性杂草,具较强的入侵性。紫茎泽兰可分泌许多克生物质抑制其它植物生长,快速侵占草地牧场、田间林地、山谷河流,给入侵地造成严重的经济损失。紫茎泽兰所含的很多植物次生物质如泽兰素A和内酯等对很多种类的昆虫有较强的化感作用[1-3]。因此,大多数昆虫都拒食或避忌紫茎泽兰,仅泽兰实蝇ProcecidocharesutilisStone专性取食紫茎泽兰。

泽兰实蝇是双翅目实蝇科昆虫,是紫茎泽兰的天敌昆虫,其幼虫专性取食紫茎泽兰茎秆的幼嫩部分,使紫茎泽兰茎秆膨大形成虫瘿,对其生长及繁殖均有一定的抑制作用[4-6]。现在已经有很多国家和地区利用泽兰实蝇对紫茎泽兰进行防治[7-8]。在20世纪80年代,泽兰实蝇越过喜马拉雅山脉,扩散并成功定殖在西藏聂拉木县,由此传入我国[9]。为了防治紫茎泽兰,云南省昆明市从西藏的聂拉木县引入泽兰实蝇,后来该虫逐步扩散到云南省的大部分地区、四川的西南部地区、贵州以及广西等省份[10-11]。

泽兰实蝇食物中的营养成分均来自紫茎泽兰,在泽兰实蝇幼虫取食的同时也摄入了大量的有害次生物质,然而幼虫并未中毒,由此说明泽兰实蝇对紫茎泽兰的毒素物质有一定的耐受或者降解作用。有研究表明,共生菌的生长可以对植物的生理进行调控,抑制植物合成一些对昆虫有不利影响的物质,从而增强昆虫的抗逆性[12-18];昆虫内共生菌还可对宿主昆虫所摄取的植物次生物质(如生物碱、氰苷等)进行解毒作用,例如苹果绕实蝇(Rhagoletispomonella)中的聚团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)可以将植物源有毒物质根皮苷降解脱毒,有利于苹果绕实蝇的存活[19]。在泽兰实蝇幼虫体内同样有共生菌的生长,共生菌在协助其宿主营养代谢的过程中,可能也有一定的解毒作用。但在目前泽兰实蝇共生菌的研究中,仅对泽兰实蝇幼虫的肠道细菌有初步的研究,还没有系统地对泽兰实蝇幼虫的内生细菌进行研究[20]。

本实验通过传统的分离鉴定与16S rDNA序列分析相结合的方法分离鉴定了泽兰实蝇幼虫内生细菌的种类,并通过圆叶片法初步研究了内生细菌的除草活性,旨在为明确泽兰实蝇对紫茎泽兰的解毒机制提供科学依据,也为更有效地控制紫茎泽兰奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

泽兰实蝇老熟幼虫采自昆明市呈贡区及本实验室所种植的紫茎泽兰虫瘿内。

1.2 研究方法

1.2.1 内生细菌的分离 对采回的虫瘿进行整体消毒后在超净工作台内解剖出泽兰实蝇幼虫,将幼虫体表灭菌后解剖,获得体内各组织[21]。分别收集所获得的各组织于离心管内,研磨后梯度稀释制备菌悬液。取10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液各0.1 mL,分别接种在NA培养基上,每个梯度做3个重复[22]。将接菌后的培养皿倒置,于28 ℃培养2 d[23]。待长出单菌落后,进行纯化培养。纯化3～4次可得纯化后的菌株[24]。

1.2.2 菌落特征的观察 挑取纯化后的单菌落，在LB培养基平板上划线接种,于28 ℃培养2 d,待长出单菌落后观察其形态[25]。

1.2.3 菌体形态的观察 挑取纯化后的单菌落，在LB培养基平板上划线接种,于28 ℃培养2 d,获得单菌落。挑取单菌落涂布于载玻片上,做革兰氏染色[26]。将做好的玻片放在油镜下观察菌体的形态,测定菌体的大小,并记录革兰氏染色结果。

1.2.4 生理生化测定 将分离纯化出来的菌株做细菌的生理生化实验[27]。

1.2.5 16S rDNA的扩增和测序 将所纯化分离的细菌做16S rDNA基因序列鉴定。对根据形态特征归类的微生物类群,用试剂盒提取代表性单菌落的DNA,具体方法根据试剂盒说明书。将提取的DNA用于细菌高变动区段V4区的体外扩增，引物为16S V4区通用引物[28]。回收纯化PCR产物,与pJET载体连接,进行BJIⅡ酶切鉴定。用基因转录间隔区引物对(515F和608R)扩增到400 bp左右的基因转录间隔区及核糖体DNA基因片段。由昆明擎科生物公司对16S rDNA扩增产物进行双向测序,对所得序列在NCBI上进行BLAST比对分析。

1.2.6 共生菌对紫茎泽兰叶片的影响 共生菌对紫茎泽兰叶片影响的测定采用叶圆片法。选取紫茎泽兰植株固定部位大小一致的叶片,在清水里冲洗一段时间；取出叶片晾干,用30%过氧化氢对叶表面灭菌。将灭菌后的滤纸平铺于无菌培养皿内,实验组加入5 mL于摇床培养24 h的菌悬液,对照组加入5 mL的无菌水。用直径为6 mm的打孔器打取紫茎泽兰叶圆片,将叶背面向上平放于铺有滤纸、装有5 mL菌悬液或无菌水的培养皿内,用保鲜膜封口后置于(25±2)℃、L∶D=12 h∶12 h的培养箱内培养,每隔24 h统计一次结果。采用分级统计方法记录紫茎泽兰叶圆片的受害情况。评价菌悬液对叶圆片侵害程度的标准如表1所示[29]。侵害指数的计算公式如下：

表1 评价菌悬液对叶圆片侵害程度的标准

2 结果与分析

2.1 菌落特征

通过分离纯化泽兰实蝇幼虫的内生细菌,共获得22株细菌,将其标号为ZLSY1～ZLSY22,并进行菌落特征观察记录,将结果列于表2。

2.2 菌体的形态特征

对所分离的22株菌在10×100倍油镜下进行菌体特征及革兰氏染色结果的观察,结果如表3。由表3可知：有9株菌产芽孢；仅有4株菌为圆球形或者椭球形,其余18株菌均为杆菌；有13株菌为革兰氏阳性菌,有9株菌为革兰氏阴性菌。

2.3 生理生化特性

由表4可知:在22株菌中,有7株菌能分泌淀粉水解酶水解淀粉;有2株菌能水解油脂;有19株菌在石蕊牛奶实验中产生反应;在明胶液化实验中产生反应的有16株菌;有8株菌不水解硫化氢,反应结果为阴性。在葡萄糖发酵实验中，既产酸又产气的有3株菌,只产酸不产气的有3株,其余均既不产酸又不产气;在乳糖发酵实验中，仅有1株菌既产酸又产气,有2株既不产酸又不产气,剩余19株菌只产酸不产气；在吲哚实验中,有10株菌呈阳性反应;在甲基红实验中有7株菌呈阳性反应;在伏-普实验中有9株菌呈阳性反应;在柠檬酸盐实验中有8株菌可以使其变色而呈阳性反应。

表2 泽兰实蝇幼虫内生细菌的菌落特征

表3 泽兰实蝇幼虫内生细菌的菌体特征及革兰氏染色结果

2.4 16S rDNA序列分析

对分离纯化后的22株菌进行16S rDNA序列分析,结果如表5。表5所列是所扩增的片段与GenBank中已发表的细菌基因序列的同源性均在98%以上的基因序列。从分子水平鉴定了所分离的细菌种类,在所分离的22株泽兰实蝇内生细菌中，有1株菌未被鉴定出来，其余21株菌隶属10个属,分别为迪茨菌属(Dietzia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、莫拉菌属(Moraxella)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)。其中6株菌属于泛菌属,5株菌属于芽孢杆菌属,3株菌属于类芽孢杆菌属,其余属均只有1株菌。

表4 泽兰实蝇幼虫内生细菌主要生理生化特性的实验结果

注:“A”表示既产酸又产气;“B”表示只产酸不产气;“C”表示既不产酸也不产气;“+”表示阳性反应;“-”表示阴性反应。

表5 泽兰实蝇内生细菌16S rDNA序列分析结果

2.5 共生菌对紫茎泽兰叶片的作用

所分离纯化的22株菌经初步筛选有6株菌在实验中效果很明显,其余菌株无作用。这6株菌分别为ZLSY2、ZLSY5、ZLSY15、ZLSY16、ZLSY20、ZLSY22。由图1可以看出，这6株菌与对照组之间的侵害效果均有显著差异,但各株菌之间差异不显著。随着培养时间的增加,6株菌对紫茎泽兰叶片的侵害程度均呈上升趋势,在72 h时ZLSY5、ZLSY16、ZLSY22这3株菌对紫茎泽兰叶片的伤害率达到97%以上。

图1 菌悬液对紫茎泽兰叶片的侵害程度

3 讨论与结论

昆虫与其共生菌之间有着十分密切的共生关系,共生菌生长于昆虫体内,昆虫为共生菌创造了稳定的生活环境并提供必要的营养物质[30-31]。本实验用形态鉴定和16S rDNA技术相结合的方法第一次分离鉴定了泽兰实蝇幼虫内可培养的内生细菌种类,一共分离得到22株菌,编号为ZLSY10的菌株未被鉴定出来,其余21株菌分属于3个门(厚壁菌门、变形杆菌门、放线菌门)、3个纲、10个属。其中变形菌门有10株菌,属于优势菌；厚壁菌门有8株菌,为次优势菌。这与张某等的研究结果有所不同,他们利用Illumina HiSeq技术对泽兰实蝇幼虫肠道细菌进行多样性分析时,共注释了13个门,其中变形菌门占99%，为优势菌[20]。出现这种差异的原因可能是所采用的方法不同,应用Illumina HiSeq技术所获得的是肠道内整体的细菌种数,包括可培养菌和不可培养菌,因此所得的物种数量较多。在昆虫体内生长的共生菌,其特殊的生长环境与昆虫的内环境息息相关,大多数菌的生长环境是体外培养不能提供的;其特殊的营养物质也受昆虫的食性以及食物来源的影响,因此可培养菌在数量上就显得稀少。然而,可培养菌株的获得在共生菌的研究中是非常有价值的,通过形态或分子鉴定明确其分类地位后,再进行生物学实验,可以明确这些菌的功能[32],并可有望从中寻找某些有益细菌进行开发或利用,如找寻可降解或耐受紫茎泽兰有毒物质的菌株。

共生菌在昆虫体内可为昆虫生长提供某些食物中缺乏的重要营养成分,补充其食物中的不足,起到调节营养平衡、调节代谢以及解毒作用[33]。在紫茎泽兰植株中,若没有某些物质的作用则植株应该均匀生长,不会出现某部分组织膨大的现象,但在有泽兰实蝇取食的部位却能形成虫瘿。虫瘿的形成可能是因为泽兰实蝇幼虫在取食过程中产生的物质改变了植株的营养代谢途径[34]；据报道，在泽兰实蝇幼虫体内分离到的菌株如不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)的细菌都具有氮素转化的功能,可以将体内固定的氮源转移到体外,供寄主植物生长利用[35-36]。因此,我们猜测泽兰实蝇体内的这两个属的细菌在虫瘿的生长上也起了主要作用,通过将氮源物质由体内转移出,累积于其生活的空间中,从而产生虫瘿并快速膨大,这样虫瘿可以增加幼虫的取食面积,并为其提供充足的食物来源[34]。

在本实验中,初步发现有6株菌可以使紫茎泽兰的叶片失绿甚至腐烂,对紫茎泽兰叶片的侵害程度较重。这6株菌分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)。芽孢杆菌属(Bacillus)在防治植物病原菌方面是被广泛应用的一类生防细菌,对多种植物病原真菌有防治作用[37];泛菌属菌株Pantoeasp. LD1有降解木质素以及水稻秸秆的作用[38],在这6株菌中有3株菌是泛菌属的;抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyveraascorbata)具有硝酸盐还原能力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐,植物体能吸收低浓度的亚硝酸盐,但高浓度的亚硝酸盐对植物体有害[39]。在微生物对紫茎泽兰叶片致病性的研究中,前人仅研究了链格孢菌的作用[29],还没有细菌致病方面的报道。鉴于以上6株细菌对紫茎泽兰的降解能力,在后续实验中,我们将从菌株的安全性入手,筛选出安全的菌株进行后续的实验。剩余的14株菌虽然对紫茎泽兰的叶片没有致病作用,但在抑菌活性、促进泽兰实蝇对紫茎泽兰的适合度方面是否存在有益作用,还有待于进一步的研究。

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