3株传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

孟凯　袁小远　张玉霞　李莉　王友令

摘要：本研究于2014—2017年从山东省发生传染性法氏囊病的鸡群中分离到3株传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）毒株，通过RT-PCR技术对3株分离毒株进行鉴定，并测定其ELD50以及对3周龄SPF鸡的致死率。结果如下：3株传染性法氏囊病病毒分离株均可导致70%以上SPF鸡的死亡，属于强毒株。通过特异性引物对3株分离株VP2基因的高变区进行扩增并测序，序列分析结果显示：3株分离株与5个超强毒株均在同一个大的分支上，同源性在96.3%～99.3%之间；与疫苗株B87和D78分属于两个分支，同源性仅为88.7%～90.6%。本研究为山东地区传染性法氏囊病的防治提供了有益参考。

关键词：传染性法氏囊病病毒；分离与鉴定；RT-PCR；VP2

中图分类号：S858.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0129-04

Abstract Three infectious bursal disease virus （IBDVs） isolates were isolated from diseased chickens in Shandong Province in 2014-2017. These virus strains were detected by RT-PCR and inoculated into 3-week-old SPF chickens to determine their ELD50 and pathogenecity. The results showed that the mortality of the infected SPF chickens was equal to or greater than 70.0%，which indicated these isolates belonged to vvIBDV. The specific primers were used to amplify and sequence the high-varying regions of the VP2 gene of the three strains.The sequence analysis results showed that the three isolates were in the same big branch with other five vvIBDVs，and the homology was 96.3%～99.3%；the three isolates were classified into different branch from vaccine strains B87 and D78， and the homology was only 88.7%～90.6%. This study provided a useful reference for the prevention and treatment of IBDV in Shandong Province.

Keywords Infectious bursal disease virus （IBDV）； Isolation and identification； RT-PCR； VP2

雞传染性法氏囊病（Infectious bursal disease， IBD）是由传染性法氏囊病病毒引起的一种主要危害雏鸡的急性、高度接触性传染病，临床上以鸡的腹泻和发热为特征，该病毒主要侵害鸡的法氏囊，导致鸡体的免疫抑制及多种疫苗免疫的失败，从而对养鸡业带来极大的危害[1]。Cosgrove[2]于1962年首次报道了鸡传染性法氏囊病，随后几十年内，该病在世界范围内发生[3]。20世纪90年代初，我国北京、广州和上海等地均报道过该病[4]。近30年来，随着临床上IBDV疫苗的普遍应用，IBDV自身不断发生变异，使IBDV的毒力增强。目前IBDV经典毒株（cIBDV）、变异毒株和超强毒株（vvIBDV）在中国并存，经常导致鸡群的免疫失败，给该病的防控带来了更大的挑战[5]。

传染性法氏囊病病毒属双RNA病毒科（Birnaviridae）、双RNA病毒属（Birnavirus）成员，其基因组由A、B两个片段组成，编码VP1、VP2、VP3、VP4和VP5五种病毒蛋白，其中A片段编码的VP2蛋白是IBDV的主要保护性抗原，为病毒的主要独立因子，能够诱导机体细胞凋亡并产生保护性中和抗体[6]。通过比对不同毒株的VP2氨基酸序列，发现VP2蛋白在206～350位内的氨基酸变化较大，称为VP2高变区（vVP2），研究发现vVP2内氨基酸的改变会导致IBDV毒力的改变[5]。本研究运用RT-PCR技术对从山东省境内发生IBD鸡群中分离到的3株IBDV毒株的VP2基因进行扩增及测序分析，从分子水平上探讨山东省近期IBDV的流行情况，为山东地区该病的防治提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株 3株IBDV分离株（SD-01、SD-02、SD-03），于2014—2017年分离自山东省不同地区传染性法氏囊病发病鸡场。

1.1.2 SPF鸡胚及SPF鸡 SPF鸡胚及SPF鸡均购自山东SPF原种鸡场。

1.1.3 试剂和仪器 DNA Marker （DL 2000 bp）、M-MLV反转录试剂盒、Trizol 总RNA提取试剂盒、SuperscriptTM RT-PCR Systems试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等，购自宝生物（大连）公司；DH5α感受态细胞、pMD18-T载体均由本实验室保存；其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 病料采集与处理 病料采自山东省不同地区传染性法氏囊病的发病鸡场，无菌采取病变严重的病鸡法氏囊组织，冷藏保存，带回实验室。

将采集的病鸡法氏囊组织融化后剪碎，放入研磨器中，加入3倍体积的灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）（1 g/mL，加入终浓度为1 mg/mL的青链霉素溶液）研磨，得到匀浆；加入等体积的氯仿，低温摇床振荡24 h（220 r/min）； 4℃、10 000 r/min离心30 min，取上清。-80℃保存备用。

1.2.2 病毒分离与纯化 将获得的上清按0.2 mL/枚的量经绒毛尿囊膜途径接种于9 ～ 10日龄SPF鸡胚，置于37℃恒温培养箱中培养，将24 h内死亡的胚弃去，收集3 ～ 5天死亡的鸡胚，观察鸡胚死亡症状。无菌收集绒毛尿囊膜并观察膜的病变情况，反复传代至第3代，将绒毛尿囊膜作为试验用种毒。

1.2.3 病毒RNA的抽提 将收集的绒毛尿囊膜及病变明显的胚体剪碎、研磨，加入5倍体积的无菌PBS制成悬液，反复冻融3次，4 000 r/min 离心10 min，取上清，按照Trizol试剂盒说明书方法抽提病毒RNA。

1.2.4 引物的设计与合成 参照GenBank上IBDV的VP2高变区基因序列，利用Primer 5.0软件分析并设计引物。引物序列如下：上游引物（VP2-F）为5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCAT-3′；下游引物（VP2-R）为5′-TATGACCGAATTCGATCCTGTTGCCA-3′。引物由北京华大基因合成。预计扩增条带大小460 bp左右。

1.2.5 VP2基因扩增 以M-MLV为反转录酶，参照说明书反转录成cDNA，以cDNA为模版扩增VP2基因。PCR扩增体系为：模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×buffer （QIANGEN） 25 μL，加入ddH2O补足50 μL。PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃ 60 s，30个循环；72℃ 3 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.6 VP2基因的克隆与测序 利用DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。回收纯化后连接pMD-18T载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，将生长良好的菌落接种于LB培养基中，扩增培养，提取质粒并进行PCR鉴定。将筛选出来的阳性重组质粒交由Invitrogen（上海）公司进行测序。

1.2.7 分离株VP2基因遗传进化分析 用MEGA 5.0软件对测定的3株分离株VP2序列及其推导的氨基酸序列与在GenBank上登录的其他毒株的VP2序列及其推导的氨基酸序列进行同源性比对，并构建系统进化树。参考毒株及其GenBank登录号如下：AH1（EU417823）、23-82（AF362773）、Harbin（AY321955）、B87（DQ202329）、BK912（AF416620）、BQ902（KT381974）、D78（AF499929）、OKYM（D49706）、GHUT-12（DQ778035）。

1.2.8 病毒鸡胚半数致死量ELD50的测定 用灭菌的PBS将IBDV病毒液进行10倍倍比稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），每个稀释度接种8枚9日龄SPF鸡胚，接种量为每胚0.2 mL，同时设立阴性对照组。根据Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50。

1.2.9 病毒对SPF鸡的致死率试验 将分离毒经点眼、滴鼻途径接种28日龄SPF鸡10羽，每羽接种剂量为10ELD50/0.2mL，同时以健康SPF鸡作为阴性对照，隔离饲养。攻毒后连续观察两周直至无死亡鸡出现为止，记录鸡只死亡情况。

2 结果与分析

2.1 分离毒株VP2基因的凝胶电泳结果

取5 μL PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示（毒株名称略去），与预期结果相符。

M：DNA分子量标准（DL 2000 bp）；1：SD-01分离株；

2：SD-02分离株；3：SD-03分离株；4：阴性对照。

图1 IBDV分离株PCR凝胶电泳图

2.2 3株IBDV分离株VP2基因的氨基酸分析 根据其他学者的研究报告[7]，IBDV超强毒株的VP2高变区氨基酸残基具有3个典型特征：（1）222、294位和299位分别为A、I和S三个特征性氨基酸；（2）249位和254位氨基酸分别为Q和G；（3）326 ～ 332位的保守七肽区为SWSGSAS，且279位和284位氨基酸分别是D和A，而非N和T，这是毒株具有高致病性的必要条件。对3株IBDV分离株的VP2高变区的氨基酸进行分析，与超强毒株的特征性氨基酸位点进行比较（表1），发现3株IBDV分离株VP2高变区的氨基酸位点均符合超强毒株特征性氨基酸位点的特征。

2.3 分离株VP2基因遗传进化分析

从图2中可以看出，3株分离株（SD-01、SD-02、SD-03）与IBDV超强毒株（AH1、OKYM、BQ902、GHUT-12、Harbin）在一个大的进化树分支上，同源性在96.3%～99.3%之间；与疫苗株B87和D78分属于两个分支，同源性在88.7%～90.6%之间。

2.4 病毒鸡胚半数致死量ELD50及对SPF鸡致死率测定结果

以绒毛尿囊膜途径接种9日龄SPF鸡胚，3株IBDV分离株均可在鸡胚上复制，且均可使鸡胚致死，鸡胚出现的症状表现有出血、水肿、发育遲缓、肝脏肿大并伴随出血、肾脏肿大并伴随出血等。

3株IBDV分离株的ELD50存在一定程度差异（表2）。人工感染SPF鸡后，鸡只发病率达100%，出现羽毛蓬松、精神萎靡、食欲减退或废绝、拉白绿色水样粪便等表观症状。对SPF鸡的致死率均在70%及以上，剖检发现鸡的法氏囊肿大出血，有些甚至呈“紫葡萄”状；胸肌、腿肌有片状出血或出血性条纹。表明这3株分离株均为超强毒。

3 讨论与结论

鸡传染性法氏囊病是一种重要的鸡免疫抑制病[8]。IBDV是一种无囊膜、由A和B两个节段构成的RNA病毒，分为血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，目前发现只有血清Ⅰ型对鸡致病。根据病毒的毒力，通常把血清Ⅰ型IBDV分成超强毒株、经典毒株和致弱毒株[9]。其中超强毒株对鸡具有很高的感染率和致死率，由于超强毒株的抗原性与经典毒株相比差异不大，常规的血清学诊断方法很难将二者区分，因此利用分子生物学方法对IBDV的分离株进行分群具有非常重要的意义。

VP2蛋白由A节段131～1453位核苷酸编码的441个氨基酸组成，VP2蛋白既是构成病毒衣壳的主要结构蛋白，也是一个变异性最大的蛋白，其206～350位氨基酸称为高变区（vVP2），该区域内任何氨基酸位点的改变都可能改变病毒的毒力，使病毒毒力增强从而突破IBDV疫苗的保护[10]。因此，对VP2基因高变区进行研究不仅能发现IBDV的抗原性变化，也能提供毒株的遗传进化信息。

之前的研究曾经把vVP2内富含S的七肽区（SWSASGS）认为是IBDV的毒力标志。1996年Yamaguchi等[7]将IBDV超强毒OKYM株的266位氨基酸I突变成T后，发现病毒毒力变弱，从而开启了IBDV其他相关位点的研究工作。本试验利用RT-PCR技术扩增分离自山东省不同地区3株IBDV的vVP2，通过对其氨基酸序列进行分析，发现3株分离株的七肽区（SWSASGS）均与已知IBDV超强毒株的完全相同，通过从9个IBDV参考毒株的VP2基因高变区核苷酸序列所绘制的系统进化树结果来看，3株分离株与5个超强毒株均在同一个大的分支上，同源性在96.3% ～ 99.3%之间，并且3株分离株对SPF鸡的感染率均达100%，死亡率均在70%以上，该结果与进化树分析结果一致，符合超强毒株的特性。说明当前在山东地区引起鸡传染性法氏囊病的流行毒株多为vvIBDV。近几年疫苗免疫失败的例子时有发生，除了人为免疫不合理以外，病毒变异和毒力增强也都有可能导致疫苗免疫失败。本试验中分离到的3株分离株与2株经典疫苗株分属于不同的进化分支上，同源性仅为88.7%～90.6%，因此经典的Ⅰ型疫苗是否还能够提供有效的保护还需作进一步证实。

参 考 文 献：

[1] 何秀苗， 陈佳， 康斯那， 等. 鸡传染性法氏囊病病毒地方流行株VP1基因片段的扩增及序列分析[J]. 动物医学进展， 2015， 36（4）： 19-23.

[2] Cosgrove A S. An apparently new disease of chickens： avian nephrosis[J]. Avian Diseases， 1962， 6（3）： 385-389.

[3] 高崧， 刘秀梵， 崔治中. 传染性法氏囊病的研究进展[J]. 动物医学进展， 2001， 22（3）： 44-49.

[4] 周蛟， 刘福致， 陈丽永， 等. 北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离[J]. 中国兽医杂志， 1982（7）：25-26.

[5] 沈巍巍， 陈果， 何秀苗， 等. 广西梧州地区近十年传染性法氏囊病病毒vVP2变化特征分析[J]. 动物医学进展， 2017， 38（3）： 32-37.

[6] 刘永相， 刘春国， 刘大飞， 等. 珍珠鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离及其VP2基因的分子遗传特征[J]. 中国兽医科学， 2015，45（3）： 293-297.

[7] Yamaguchi T， Ogawa M， Inoshima Y， et al. Identification of sequence changes responsible for the attenuation of highly virulent infectious bursal disease virus[J]. Virology， 1996， 223（1）： 219-223.

[8] 梅永杰， 王永山， 歐阳伟， 等. 华东地区传染性法氏囊病病毒流行株的分离及其生物学特性分析[J]. 中国兽医科学， 2016， 46（5）： 550-557.

[9] 王寿山， 毛雅元， 张立霞， 等. 4 株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析[J]. 中国畜牧兽医， 2013， 40（12）：48-51.

[10]韩玉婷， 何勇， 许革学， 等. 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展[J]. 河南农业科学， 2016， 45（3）： 20-23.