R9—FOXM1（1—234aa）重组蛋白批量纯化及其抑瘤效应研究

谭拥军+余景卫+陈燕+向勤+谭桂湘

摘 要：通过基因工程构建重组表达质粒pET15b-R9-FOXM1（1-234aa），转化大肠杆菌建立构建表达R9-FOXM1（1-234aa）的菌株.采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段，规模化制备纯化穿膜肽R9-FOXM1（1-234aa），获得的蛋白的纯度达到90%以上.用R9-FOXM1（1-234aa）穿膜肽处理不同的肿瘤细胞，通过MTT实验研究其细胞效应.结果显示：当R9-FOXM1（1-234aa）穿膜肽的浓度达到2 mM时，肿瘤细胞的死亡率为50%左右.实验表明穿膜肽R9-FOXM1（1-234aa）抑制不同肿瘤细胞的生长，有可能成为治疗肿瘤的潜在蛋白类药物.

关键词：多聚精氨酸；细胞穿膜肽；FOXM1；肿瘤治疗

中图分类号：Q784 文献标志码：A

Study of Scale Purification and Anti-tumor Efficacy ofR9-FOXM1（1-234aa） Recombinant Protein

TAN Yongjun，YU Jingwei，CHEN Yan，XIANG Qin，TAN Guixiang

（College of Biology， Hunan University， Changsha 410082，China）

Abstract：A recombinant protein expression vector pET15b-R9-FOXM1（1-234aa） was constructed and transformed to E. coli in order to generate a strain expressing R9-FOXM1（1-234aa）. The recombinant protein R9-FOXM1 （1-234aa） （R9-FOXM1（1-234aa）） was isolated at a large scale through His-tag affinity chromatography. The purity of the purified protein reached 90%. Moreover， MTT assay was used to test the effect of R9-FOXM1（1-234aa） on cells， and the test results showed that R9-FOXM1（1-234aa） caused the cell death of different types of cancer cells with a half lethal dose around 2 mm。 The results also demonstrated that R9-FOXM1（1-234aa） suppressed the proliferation of cancer cells and may be considered as a potential angent for anti-cancer in the future.

Key words：arginine-rich； cell-penetrating peptides； FOXM1； tumor therapy

Forkhead Box（Fox）基因广泛分布于从酵母到人的各种真核生物，构成一个庞大的转录因子家族[1]，在哺乳动物中已拥有超过40个以上的成员，分别参与调节细胞分化、增殖、代谢及细胞凋亡等生理过程[2].该家族的成员FOXM1，首先被发现是一个调控细胞周期和细胞增殖的蛋白[3].在细胞增殖过程中，FOXM1表达水平增高，并参与调节细胞周期相关的多个基因转录，从而控制细胞的DNA复制与有丝分裂过程[4-6]，还与DNA损伤修复有关[7-8].通过小鼠肝脏再生模型的研究发现，当从肝细胞中特异性敲除FOXM1基因之后，肝脏再生过程中DNA的复制降低了80%，而有丝分裂被完全抑制[5].在FOXM1被敲除的肝细胞中，细胞核内累积了大量细胞周期蛋白激酶的抑制蛋白p21Cip1和p27Kip1，从而大大降低了DNA的复制水平[5-6，9].同时，FOXM1还上调激活DNA复制所必须的Cdc25A 磷酸酶的表达[5].另一方面，FOXM1的缺失抑制了有丝分裂过程：因为FOXM1控制着许多与有丝分裂相关的基因转录，其中包括cyclin B1，Cdc25B，polo-like kinase 1（PLK1），aurora B kinase，Survivin，着丝粒蛋白A（CENPA）和CENPB基因[5-6，10-11].此外，不同器官中有条件敲除FOXM1还抑制了致癌剂所诱导的肝癌、肺癌、结直肠癌等实体瘤的发生和发展[9，12-13].

FOXM1蛋白氮端能夠通过与碳端结合，干扰FOXM1碳端的磷酸化，抑制FOXM1转录活性、竞争性阻碍FOXM1与其他肿瘤促进因子互作及促瘤信号通路对FOXM1的修饰活化作用等[14].在细胞周期G2阶段，FOXM1的激活依赖cyclin A/cdk的磷酸化，缺失N端的FOXM1不再依赖cyclin A，细胞周期被激活[15].

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是由氨基酸组成具有穿透细胞膜能力的多肽，最早从人HIV-1的TAT蛋白中发现：该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段区域[16]；多聚精氨酸作为目前已知最为简单有效的细胞穿膜肽，其中以九聚精氨酸 （R9）效率最高（大约为TAT的20倍），具有极大的研究及应用价值[17].本实验通过构建携带R9的FOXM1-N（1-234aa）原核诱导表达体系，采用His-tag亲和纯化手段进行批量纯化，选用不同肿瘤细胞株，研究重组蛋白对肿瘤细胞的影响.endprint

1 材料与方法

1.1 材 料

乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549来源于（American Type Culture Collection，ATCC），二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）由上海生工提供，DMEM培养基和1640培养基均为GIBCO公司产品，HisTrapTMFF.crude，AKTA均由GE公司提供.

1.2 方 法

1.2.1 pHis-FOXM1（1-234aa）-R9的构建

设计NcoI，BamHI限制性内切酶上下游引物，引物序列如下：

引物1（上游引物）：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG AAA ACT AGC CCC CGT CG.

引物2（下游引物）：GCG GAT CCC TAC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTA GAC ACA GAG TTC TGC CAG G.

以pcDNA3.1-FOXM1為模板，在引物1和引物2的引导下PCR扩增反应体系为：克隆质粒pcDNA3.1-FOXM1（80 ng/μL）1 μL，10X PCR Buffer for KOD-PLus-Neo5 μL，dNTPs（2 mM each）5 μL，MgSO4溶液（25 mM）4 μL，KOD-PLus-Neo（1.0 U/mL）1 μL，引物1（100 nM）1 μL，引物2（100 nM）1 μL，DMSO2 μL，加去离子水补充至反应体系50 μL.PCR反应条件：先94 ℃ 5 min；再95 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s，共30个循环；然后68 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min.反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化扩增的目的片段，纯化产物溶于40 μLTE缓冲液中，-20 ℃冻存备用.

利用NcoI，BamHI限制性内切酶切出克隆片段的粘性末端.酶切体系：目的片段（150 ng/mL）或pET-15b质粒（150 ng/mL）6.7 μL，NcoI限制性内切酶0.5 μL，BamHI限制性内切酶0.5 μL，10X FastDigest Buffer1 μL，加去离子水至总体积10 μL，37 ℃水浴反应30 min.

将NcoI，BamHI限制性内切酶处理的目的片段和载体进行连接，连接体系及反应条件为：酶切载体5.63 μL，酶切目的片段2.36 μL，T4 DNA Ligase（5 U/mL）1 μL，10X T4 DNA Ligase buffer1 μL，加去离子水至反应体系10 μL.22 ℃反应20 min，-20 ℃冻存备用.

取一管DH5α感受态细胞置于冰上溶解，待感受态完全溶解后，加入1 μL的连接片段，用拇指轻弹混匀，冰上放置30 min.热激过程：42 ℃热激90 s，冰上放置2 min；加入1 mL的LB培养基，37 ℃放置45 min；取200 μL涂布LB平板（氨苄青霉素浓度为25 μg/mL），37 ℃培养过夜（12～16 h）；挑取单克隆，接种到5 mL的LB培养液（含25 μg/mL 氨苄青霉素） 37 ℃ 振荡培养过夜（12～16 h）.提取质粒，用限制性内切酶NcoI，BamHI进行酶切鉴定，保种并分装测序.pHis-FOXM1（1-234aa）-R9原核表达质粒结构示意图（图1（a））.

1.2.2 重组蛋白的规模化制备及检测

将表达载体pHis-FOXM1（1-234aa）-R9转化大肠杆菌Rostta DE3感受态细胞，37 ℃培养过夜（12～16 h），随机挑选一个单克隆，接种到5 mL的LB培养基（含25 μg/mL 氨苄青霉素和25 μg/mL 氯霉素），37 ℃振荡培养4～6 h.将菌液加到100 mL的LB培养液（含25 μg/mL 氨苄青霉素和25 μg/mL 氯霉素）37 ℃振荡培养过夜（12～16 h），取菌液检测OD600值，调整OD600值至0.8～1，加入IPTG诱导剂（终浓度0.8 mM），30 ℃诱导振荡培养6 h.4 000 r/min离心20 min收集菌体，用15 mL Binding Buffer（20 mM Na3PO4， 500 mM NaCl， 20 mM imidazole， pH 7.4）重悬菌体，超声40 min（超3 s，停2 s）破碎菌体.细菌裂解液采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段，纯化后蛋白利用SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白.

根据上述确认的菌液进行扩大培养，在8瓶500 mL的摇瓶进行培养，37 ℃振荡培养过夜，取菌液检测OD600值，调整OD600值至0.8～1，加入IPTG诱导剂，30 ℃诱导振荡培养6 h.4 000 r/min离心20 min收集菌体，用15 mL Binding Buffer重悬菌体，超声40 min破碎菌体.裂解液用HisTrapTMFF.crude亲和层析方法，通过GE AKTA蛋白纯化系统，用不同强度的离子浓素洗脱，收集吸收峰出现的样品，然后利用SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白.

1.2.3 MTT法检测细胞活性

取对数期细胞，以每孔20 000个细胞接种到96孔板，每孔100 μL培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h.吸出培养基，加入纯化的蛋白，蛋白按照5个浓度梯度，5个平行样处理细胞，置于培养箱中培养24 h.每孔加入20 μL MTT培养4 h，小心吸出上清，每孔加100 μL DMSO，用酶标仪测定492 nm的吸光度OD值.利用Origin 9.0软件系统绘制曲线.

2 实验结果endprint

2.1 pHis-FOXM1（1-234aa）-R9的构建

PCR扩增R9-FOXM1（1-234aa）目的基因，1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，条带位于700bp位置，如图1（b）所示.构建的重组表达质粒pHis-FOXM1（1-234aa）-R9经NcoI，BamHI限制性内切酶处理，结果如图1（c）所示，1号样品符合结果，测序结果比对，与理论序列一致.

2.2 重组蛋白R9-FOXM1（1-234aa）的批量纯化及鉴定

裂解液采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段，采用不同洗脱强度收集纯化蛋白，实现规模化制备纯化穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-234aa）的重组蛋白，并获得纯化过程的HPLC分析谱图图2（a），横坐标表示洗脱体积，纵坐标表示吸收峰UV280.吸收峰曲线代表整个过程中UV280检测结果，阶梯状曲线代表洗脱液的离子强度（实验过程中采用梯度洗脱），箭头为重组蛋白吸收峰.SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白制备不同阶段的蛋白样品，上样量均为10 μg（图2（b），AKTApurifier蛋白纯化仪纯化过程中不同时间段纯化蛋白的纯度，100%洗脱时目的蛋白的纯度高，箭头为目的蛋白的位置.Lane1：Marker Lane2：sample Lane3：filtered sample Lane4：No binding sample Lane5：0% elutionB Lane6：30% elutionB Lane7：100% elutionB）.

2.3 重组蛋白R9-FOXM1（1-234aa）对肿瘤细胞的抑制效应

MTT实验验证重组蛋白对肿瘤细胞增殖表型的影响：选择乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549、肝癌HepG2细胞，用不同浓度的重组蛋白（1 μmol/L，3 μmol/L，5 μmol/L，7 μmol/L，9 μmol/L）进行处理，24 h时后检测细胞的活性，R9-GFP处理作为对照，获得剂量依赖曲线，如图3（a）不同浓度重组蛋白处理231细胞，24h后细胞的影响，图3（c）不同浓度重组蛋白处理A549细胞，24h后细胞的影响，图3（e）不同浓度重组蛋白处理HepG2细胞，24h后细胞的影响.针对所选细胞，固定重组蛋白处理浓度（1 μmol/L），在处理后不同时间点（1 d，2 d，3 d）检测细胞活性，获得相关细胞的生长曲线，图3（b）1 μmol/L重組蛋白处理231细胞，3d内细胞活性变化，图3（d）1 μmol/L重组蛋白处理A549细胞，3d内细胞活性变化，图3（f）1 μmol/L重组蛋白处理HepG2细胞，3d内细胞活性变化.实验结果表明，R9-FOXM1（1-234aa）对不同的肿瘤细胞都具有一定的抑制作用.

3 结 论

转录因子FOXM1能刺激细胞增殖、增强DNA损伤修复能力、维持细胞干性、促进细胞迁移，并被作为肿瘤治疗的分子靶标，抑制FOXM1有效抑制肿瘤的发生和发展.FOXM1蛋白氮端抑制FOXM1转录活性、竞争性阻碍FOXM1与其他肿瘤促进因子互作及促瘤信号通路对FOXM1的修饰活化作用等.本实验研究结合多聚精氨酸R9穿膜肽，构建了穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-234aa）的原核表达质粒；采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段，规模化制备穿膜肽R9-FOXM1（1-234aa）.相对手动纯化，实验纯化手段具有蛋白纯度高，产量高，时间短等明显优势.为进一步的活体实验提供充足的材料.细胞水平上选择了不同类型的肿瘤细胞（乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549、肝癌HepG2）开展实验，证实了R9-FOXM1（1-234aa）对肿瘤细胞的抑制作用，R9-FOXM1（1-234aa）具体的作用机制还需要进一步的研究.本研究为R9-FOXM1（1-234aa）成为新型抗肿瘤蛋白类药物提供了初步理论基础.

参考文献

[1] KAESTNER K H，KNOCHEL W，MARTINEZ D E. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors [J]. Genes Development，2000，14（2）：142-146.

[2] HANNENHALLI S，KAESTNER K H. The evolution of Fox genes and their role in development and disease[J]. Nature Review Genetics，2009，10（4）：233-240.

[3] YE H，KELLY T F，SAMADANI U，et al. Hepatocyte nuclear factor 3/fork head homolog 11 is expressed in proliferating epithelial and mesenchymal cells of embryonic and adult tissues[J]. Molecular Cell Biology，1997，17（3）：1626-1641.

[4] YE H，HOLTERMAN A X，YOO K W，et al. Premature expression of the winged helix transcription factor HFH-11B in regenerating mouse liver accelerates hepatocyte entry into S phase[J]. Molecular Cell Biology，1999，19（12）：8570-8580.

[5] WANG X，KIYOKAWA H，DENNEWITZ M B，et al. The Forkhead Box m1b transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regeneration[J]. Proceeding of the National Academy of Science USA，2002，99（26）：16881-16886.endprint

[6] WANG I C，CHEN Y J，HUGHES T，et al. Forkhead box M1 regulates the transcriptional network of genes essential for mitotic progression and genes encoding the SCF （Skp2-Cks1） ubiquitin ligase [J]. Molecular Cell Biology，2005，25（24）：10875-10894.

[7] TAN Y，RAYCHAUDHURI P，COSTA R H. Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes[J]. Molecular Cell Biology，2007，27（3）：1007-1016.

[8] TAN Y，CHEN Y，YU L，et al. Two-fold elevation of expression of FoxM1 transcription factor in mouse embryonic fibroblasts enhances cell cycle checkpoint activity by stimulating p21 and Chk1 transcription [J]. Cell Proliferation，2010，43（5）：494-504.

[9] KALINICHENKO V V，MAJOR M L，WANG X M B，et al. Foxm1b transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19ARF tumor suppressor [J]. Genes Development，2004，18（7）：830-850.

[10]KRUPCZAK-HOLLIS K，WANG X，KALINICHENKO V V，et al. The mouse Forkhead Box m1 transcription factor is essential for hepatoblast mitosis and development of intrahepatic bile ducts and vessels during liver morphogenesis [J]. Developmental Biology，2004，276（1）：74-88.

[11]WANG X，QUAIL E，HUNG N J，et al. Increased levels of forkhead box M1B transcription factor in transgenic mouse hepatocytes prevent age-related proliferation defects in regenerating liver [J]. Proceeding of the National Academy of Science USA，2001，98（20）：11468-11473.

[12]KIM I M，ACKERSON T，RAMAKRISHNA S，et al. The Forkhead Box m1 transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer[J]. Cancer Research，2006，66（4）：2153-2161.

[13]YOSHIDA Y，WANG I C，YODER H M，et al. The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer [J]. Gastroenterology，2007，132（4）：1420-1431.

[14]PARK H J，WANG Z，COSTA R H，et al. An N-terminal inhibitory domain modulates activity of FoxM1 during cell cycle [J]. Oncogene，2008，27（12）：1696-1704.

[15]LAOUKILI J，ALVAREZ M，MEIJER L A，et al. Activation of FoxM1 during G2 requires cyclin A/Cdk-dependent relief of autorepression by the FoxM1 N-terminal domain [J]. Molecular and Cellular Biology，2008，28（9）：3076-3087.

[16]REGBERG J，SRIMANEE A，LANGEL U，et al. Applications of cell-penetrating peptides for tumor targeting and future cancer therapies [J]. Pharmaceuticals （Basel），2012，5（9）：991-1007.

[17]SCHMIDT N，MISHRA A，LAI G H，et al. Arginine-rich cell-penetrating peptides [J]. FEBS Letters，2010，584（9）：1806-1813.endprint