高效液相色谱法测定饮料中B族维生素

忻欣，高飞，韩莹，张宏伟，何悦

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.北京迈迪安生物科技有限公司，北京100022；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；4.北京检验检疫检测中心，北京100026）

B族维生素是很多重要酶的辅酶，缺乏将会导致与之相关的某些疾病的发生[1-2]，具最近研究报道，B族维生素具有一定的改善沮丧情绪的作用[3]，提高身体机能[4]的功能以及对糖尿病人的大脑的保护作用[5]。B族维生素人体无法自身合成，必须从食物中摄取[6]。我国食品安全国家标准中B族维生素的检测方法为单独一种维生素单独测定，无法进行多种B族维生素同时检测。如VB1采用高效液相色谱串联荧光检测器（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector，HPLC-FLD）的方法或者荧光分光光度计方法[7]，VB2采用HPLC-FLD或者荧光分光光度计方法[8]，VB6采用HPLC-FLD或者微生物方法[9]，VB12采用微生物方法或者高效液相色谱串联紫外检测器（High Performance Liquid Chromatography-UV Detector，HPLC-UV）方法[10-11]，烟酰胺采用微生物方法或者HPLC-UV方法[12]等等，由于食品安全国家标准的方法无法同时测定多种B族维生素，不太适合用于日常产品品质监控。多种B族维生素同时检测也逐渐成为研究热点，具文献报道，研究者常使用HPLC-UV/FLD法[13-15]，HPLC-化学发光法[16]和HPLC-MS法[17]等。超高效液相色谱-串联质谱法高效快速，但检测成本高，高效液相色谱法对B族维生素可进行定性和定量分析，具有相对快速、分析灵敏度较高和回收率高等优点，成为最常用的检测方法。本研究建立一种简便、快速、准确和灵敏的测定饮料中B族维生素的HPLC-UV方法，可在20 min内一次性分析5种B族维生素。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪-紫外检测器：美国安捷伦公司；ML204电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；（烟酰胺），（盐酸吡哆醇）和VB12标准品：美国Sigma公司；色谱纯甲醇、乙腈：德国默克公司；18 MΩ水由Milli-Q纯水仪制。

1.2 溶液的配制

标准储备溶液的配制：称取适量的维生素标准品，用水配制成100 μg/mL的标准储备溶液，于4℃冰箱内保存备用。

1.3 液相色谱分析条件

色谱柱：PhenomenexODS3C18柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：A超纯水，B乙腈，C甲醇，洗脱梯度条件为：0 min～9 min，94%A，3%B，3%C；9 min～20 min，90%～80%A，10%～20%B；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长为 266 nm；进样量：5 μL。

1.4 样品前处理

取2 mL左右饮料样品，经0.22 μm水系滤膜过滤，收集滤液直接上样。如样品较为粘稠或维生素含量偏大可以使用超纯水进行稀释后经0.22 μm水系滤膜过滤，收集滤液直接上样，含气饮料事先进行30 min超声脱气。

2 结果与分析

2.1 检测波长的优化

使用紫外分光光度计对标准样品进行190 nm～400 nm波长扫描，VB1最大吸收波长为263 nm，VB2最大吸收波长为266 nm，烟酰胺最大吸收波长为262 nm，VB6最大吸收波长为291nm，VB12最大吸收波长为278nm，由于烟酰胺和VB6的出峰时间相近，因此无法进行波长调整，最终选择266 nm作为检测波长。

2.2 流动相体系的选择

本研究对参考前人研究进行一系列流动相体系的选择，通过调整流动相pH值、调整梯度范围和调整有机溶剂的成分最终确定最佳的梯度洗脱程序。

磷酸二氢钾和乙腈水溶液体系：对该体系进行梯度洗脱条件、pH值3～6和磷酸二氢钾浓度[18-19]调整。试验结果表明，无论原始参考文献方法还是改进方法均容易出现出峰时间和基线不稳定，检测时间较长时容易导致基线不稳，尤其是在进行梯度洗脱的时候基线波动过大，导致定量困难，而且分析时间长达35 min，因此淘汰此体系。

甲醇和水溶液体系：对甲醇水溶液体系进行梯度洗脱条件和pH值3～6调整。试验结果表明，该体系无法全部分离出5种B族维生素，且出现3个馒头峰，因此淘汰此体系。

乙腈和水溶液体系：对乙腈水溶液体系进行梯度洗脱条件和pH值3～6调整。试验结果表明，5%乙腈浓度，可以将各个成分分开，VB2和VB12分离时间过长；梯度洗脱条件下，在0 min～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min，5%～30%的梯度洗脱条件下，VB2和 VB12在较短的时间内进行了分离，但是VB6的峰形较差；使用乙酸调整水的 pH 值至 3、4、5 和 6，在 0～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min 5%～30%的梯度洗脱条件下，烟酰胺的峰形很差，出现前拖尾峰。该体系无法用于定量，因此淘汰此体系。

甲醇、乙腈和水溶液体系：对甲醇、乙腈和水溶液体系进行梯度洗脱条件调整。试验结果表明，在0～10 min使用3%乙腈、3%甲醇和水溶液体系进行洗脱，在10 min～20 min使用乙腈3%～30%进行梯度洗脱，试验结果表明各个组分均得以分开，峰形对称。因此选用该体系进行下一步的试验。

2.3 标准品色谱图

根据1.3的色谱条件和1.4的方法进行操作，得出标准品和样品的色谱图见图1，色谱图横坐标为分离时间（min），纵坐标为266 nm检测波长下紫外吸光度（mAu）。由图1可知，所得5种B族维生素色谱峰形对称，基线平稳，且样品中的5种B族维生素和杂质的分离度好。

2.4 标准曲线及回归方程

将B族维生素的标准品分别稀释制成浓度为1.0、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的标准溶液。根据相应的峰面积和对应的检测浓度制作标准曲线（见表1），此标准曲线的相关系数为R2=0.997 5～0.999 4。

图1 混合标准品（a）和饮料样品（b）色谱图Fig.1 Chromatograms of vitamin B standard mixture（a）and drinks（b）

表1 B族维生素标准曲线Table 1 The standard curves of B vitamins

2.5 检测限

将各种B族维生素标准品制成一系列不同浓度的标准品溶液，以信噪比S/N=3时的质量浓度作为检出限，得到VB1最低检测浓度为1 μg/mL，VB2最低检测浓度为 0.1 μg/mL，烟酰胺最低检测浓度为 1 μg/mL，VB6最低检测浓度为 1 μg/mL，VB12最低检测浓度为 0.1 μg/mL。

2.6 精密度和回收率

分别取 1、10 μg/mL 和 20 μg/mL 的各个 B 族维生素标准品溶液，连续进样3次，每次进样5 μL，根据峰面积计算其相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2 精密度试验结果（n=3）Table 2 Results of precision assay（n=3）

由表2可知，各个样品测定结果的重现性较好，平均回收率95.75%～102.07%，RSD均小于3%，该色谱分析方法对于B族维生素的分析是准确、可信。

3 结论

本文建立一种高效液相色谱-紫外法测定饮料中5种B族维生素的检测方法，采用直接或者稀释后0.22 μm滤膜过滤直接上样，使用Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，采用水、乙腈、甲醇三相梯度洗脱，紫外检测波长为266 nm。试验结果表明，本方法前处理简单，灵敏度和准确度高，可以满足对饮料产品中（烟酰胺），（盐酸吡哆醇）和5种B族维生素快速检测要求。

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