赤小豆纳豆发酵工艺的研究

付文静，王家林，张杰

（青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266042）

纳豆是一种以黄豆为主要原料，蒸煮后经过纳豆芽孢杆菌发酵而成的古老豆制食品，在日本，食用纳豆的历史已长达两千多年[1]。纳豆中含有丰富的功能物质，具有较高的营养价值，近几年来成为微生态食品的研究热点[2]。纳豆中的纳豆激酶，具有较强的纤溶活性，可以帮助治疗血栓类疾病，降低心脑血管疾病的发病率，稳定血压，溶解血栓，有望成为新型溶栓制剂[3]，纳豆中含有较高含量的维生素K2，可增加骨密度，预防骨质疏松，纳豆中还含有染料木素和胰蛋白酶抑制剂，能够抗菌消炎，防毒防癌[4]。赤小豆俗称红豆，广泛种植于我国各地，赤小豆含有丰富的蛋白质、碳水化合物以及VA1、VB1、VB2等功能物质，具有清热解毒、减肥消肿、健脾利湿、消积化瘀等疗效，经过蒸煮的赤小豆香糯可口，色泽鲜亮，深受人们的喜爱[5]。虽然纳豆的营养价值很高，但国人很难接受制作纳豆时由于腐败而产生的氨臭味[6]，导致纳豆食品在我国消费群体中尚未普及，很多人对纳豆敬而远之。所以，本试验在传统纳豆发酵底物黄豆中添加一定量赤小豆，尝试改变传统纳豆的风味，以纳豆激酶的活性及感官评价为指标进行分析，提高纳豆产品的质量，改善纳豆口味，开发新产品，促进纳豆产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、赤小豆：颗粒饱满，形态完整，均购自青岛市利群超市；纳豆芽孢杆菌：青岛科技大学生物工程试验室保藏菌种；纤维蛋白原（分析纯）：美国Sigma公司；凝血酶（分析纯）：山东日照海峰制药有限公司；酪蛋白（分析纯）：甘南州科瑞乳品开发有限公司；尿激酶（分析纯）：青岛邦凯高新技术材料有限公司。

1.2 仪器与设备

离心机（LG10-2.4A）：北京京立离心机有限公司；生化培养箱（LRH-250）：上海一恒科学仪器有限公司；洁净工作台（SW-CJ-1FD）、不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-18SI）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 培养基

酪素培养基：琼脂粉20 g，酪素5 g，葡萄糖1 g，酵母膏 1 g，K2HPO41 g，KH2PO40.5 g；pH 7.0～7.2，0.1 MPa灭菌30 min。

LB 培养基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每试管分装 2 mL，0.1 MPa灭菌30 min。

种子培养基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 5 g，蒸馏水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每个三角瓶分装200 mL，0.1 MPa灭菌30 min。

1.4 方法

1.4.1 纳豆芽孢杆菌的活化及生长曲线的测定

将试验室保藏菌株在斜面培养基活化24 h，用接种环小心挑取单菌落，转接种于装有液体种子培养基的锥形瓶中，装液量为40 mL/250 mL，于37℃、180 r/min摇床恒温培养，每隔3小时取种子液，用分光光度计测其OD660数值，以时间为横坐标，所测数值为纵坐标作图，即为纳豆芽孢杆菌生长曲线[7]。

1.4.2 指标评定

1.4.2.1 纳豆激酶活性的测定

纳豆激酶酶活的具体测定方法是采用了改进的纤维蛋白平板法，尿激酶与纳豆激酶具有相似的纤溶活性，当凝血酶与血纤维蛋白原作用后，会产生凝固状的交联血纤维蛋白，此时再加入纳豆激酶或尿激酶溶液，纳豆激酶或尿激酶就会作用于交联血纤维蛋白，使其溶解[8]。

在采用传统的平板法测酶活时，形成的透明圈往往形状不均，呈不规则的圆形，无法直观的测量透明圈面积，所以，本试验进行了改进，依照平板法的制作方法[9]，在比色皿内，加入一定比例的纤维蛋白原和凝血酶，制成微型纤维平板，然后在每个比色皿内加入配置成的不同浓度梯度（125、250、500、1 000、2 000 U）的标准尿激酶。在纤维平板形成反应开始的2 h之间，每隔30分钟测定一次OD655值；计算出在每个时间内的OD655值同初始OD655值的差值ΔOD655。利用最小二乘法算出直线的斜率ΔOD655/h。用计算所得斜率同尿激酶浓度的对数作图，便可得到相对应的尿激酶标准曲线。

取不同发酵条件下的样品纳豆激酶粗酶液10 μL，点样于比色皿内微型纤维平板上，按照相同的方法进行测定其吸光度减少值，参照尿激酶标准曲线，即可比较不同样品纳豆激酶的酶活。

1.4.2.2 感官评定

随机选取10名青岛科技大学海洋科学与生物工程学院志愿者，按照感官评分标准表对赤小豆纳豆产品进行打分，分值从0至10分不等。纳豆感官评分标准见表1。

表1 纳豆感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of natto

1.4.3 工艺流程

按照以下流程对赤小豆纳豆进行单因素和正交发酵试验。

大豆、赤小豆→精选→清洗→浸泡→蒸煮→接种→发酵→后熟→成品[10]

1.4.3.1 操作要求

大豆、赤小豆选择：精选颗粒饱满、色泽鲜亮的大豆、赤小豆，无沙粒等杂质，用清水洗净；浸泡：过夜浸泡14 h～16 h，水与大豆以质量比1∶3的比例进行浸泡；蒸煮：高温高压灭菌锅中于121℃蒸煮30 min，蒸煮豆子至绵软；接种菌液：以3%的接种量进行接种；待豆子冷却到50℃左右接种；发酵：按照试验设定条件（不同发酵时间、发酵温度、赤小豆与大豆的原料比）进行发酵；后熟：于4℃左右条件下后熟24 h。

1.4.3.2 单因素试验

研究发酵温度、发酵时间、原料比对赤小豆纳豆的影响。即保持其中两个因素不变，改变另一个因素，研究该因素的变化对纳豆激酶酶活及感官评价的影响。分别在发酵温度为 30、34、38、42、46 ℃；发酵时间为 10、14、18、22、26 h；赤小豆与黄豆质量比为 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5（共 50 g）的条件下进行试验，每项因素进行3次平行试验，取平均值记录，以纳豆激酶产量和感官评价的加权分值为指标进行分析。

综合分数=0.5×（纳豆激酶酶活/纳豆激酶酶活最大值）×10+0.5×（感官评分/感官评分最大值）×10

1.5 正交试验

在单因素试验的基础上，进行正交试验设计，以纳豆激酶活性和感官评价的加权分值为指标进行工艺的优化，以确定最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌生长曲线

本试验所得菌种生长曲线以培养时间（种龄）为横坐标，以吸光度OD660数值为纵坐标作图，可得菌种的生长曲线，纳豆芽孢杆菌生长曲线见图1。

图1 纳豆芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

由图1可知，纳豆芽孢杆菌在3 h～17 h时菌体浓度增长十分缓慢，处于环境适应期，生长几乎停滞；17 h～25 h时，在培养基内营养物质丰富的条件下，菌体大量繁殖，菌体浓度呈指数上升状态；25 h～30 h为生长稳定期，菌体数量趋于稳定，菌体开始产生各种代谢产物；30 h后菌体处于衰亡期，此时培养基内营养物质减少，甚至被消耗殆尽，菌体数目减少。因此，综合比较，选用种龄为23 h的芽孢杆菌进行后续发酵试验。

2.2 标准尿激酶曲线

利用紫外分光光度计测定一系列不同浓度标准尿激酶溶液加入微型纤维平板后在655 nm处的吸光度值，以尿激酶酶活对数为横坐标，△OD655/h为纵坐标作图，标准尿激酶曲线见图2。回归方程为y=0.018 33x-0.036 7，R2=0.998 68。

图2 尿激酶标准曲线Fig.2 Standard curve urokinase activity

2.3 单因素试验结果

2.3.1 发酵温度对产品品质的影响

测定发酵温度为 30、34、38、42、46 ℃时赤小豆纳豆的感官评分及纳豆激酶酶活，计算综合分数，发酵温度对产品品质的影响如图3所示。

图3 发酵温度对产品品质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on product quality

由图3可知，随着发酵温度的升高，赤小豆纳豆成品的感官评分和纳豆激酶活性数值均为先升高，后降低。当发酵温度为38℃时，感官评分和纳豆激酶活性都是最高值。纳豆芽孢杆菌处于最适温度时，菌体生长旺盛，其内部各种酶代谢活跃，可充分发挥各自的功用，温度过高或过低都会影响细菌的代谢与增殖，降低其生理活性，温度过高也可能引起纳豆激酶失活，并且，温度过高时，纳豆色泽暗淡，形态瘪软，感官评价不佳，因此，确定38℃为赤小豆纳豆发酵的最佳温度。

2.3.2 发酵时间对产品品质的影响

测定发酵时间为 10、14、18、22、26 h 时赤小豆纳豆的感官评分及纳豆激酶酶活，计算综合分数，发酵时间对产品品质的影响如图4所示。

图4 发酵时间对产品品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on product quality

由图4可知，随着发酵时间的增加，赤小豆纳豆成品的感官评分先升高，后降低，发酵时间为22 h时产品的感官评价最佳，此时的纳豆色泽鲜亮，拉丝细长黏稠，口感润滑；发酵时间过短时，无明显的纳豆香气；发酵时间过长时，豆类发酵积累的酸臭和氨味增加，影响感官评价。

而纳豆激酶活性随时间的延长不断升高。当发酵时间为10 h～18 h时，酶活急剧升高，当发酵时间为18 h～26 h时，酶活升高不明显。因此综合感官评分和纳豆激酶酶活，确定22 h为发酵时间的最佳值。

2.3.3 原料比对产品品质的影响

测定赤小豆与黄豆质量比为1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5∶5时赤小豆纳豆的感官评分及纳豆激酶酶活，计算综合分数，原料比对产品品质的影响如图5所示。

图5 原料比对产品品质的影响Fig.5 Effect of feed ratios on product quality

由图5可知，随着赤小豆与黄豆的质量比的不断增大，产品感官评分先上升，后下降，在质量比为2∶8处出现峰值，此时的赤小豆纳豆颜色对比鲜明，秀色可餐。而相比之下，随着赤小豆与大豆的质量比不断加大，产品的纳豆激酶活性呈现下降趋势，在质量比为1∶9处最大，这可能是由于大豆中所含适合纳豆菌发酵的底物营养成分较高。综合感官评价与纳豆激酶活性的最终分数，选取赤小豆∶黄豆=2∶8，即1∶4为最佳原料比。

2.4 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 赤小豆纳豆发酵工艺优化正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal experimental design and result for fermentation technology optimization of Phaseolus angularis natto

由表2中的数据可知，本试验选取的3个因素对赤小豆纳豆的综合评价影响力大小为：发酵温度＞发酵时间＞原料比，通过k值比较可得，最优组合为：发酵温度38℃，发酵时间22h，赤小豆与纳豆原料比2∶8。由于该组合在上述正交试验的组合中没有出现，经过比较发现，与第2、5组试验相似，因此需要进行追加试验进行验证。

在发酵温度为38℃，发酵时间为22 h，赤小豆与纳豆原料比为2∶8时进行3次平行试验发现，在此条件下进行发酵所得的赤小豆纳豆感官评价较高，色泽、口感均佳，对其进行纳豆激酶酶活的测定，酶活达942 U/g，优于正交试验表中的任何一组试验结果。

3 结论

通过试验发现，赤小豆纳豆的最佳发酵工艺参数为：发酵温度38℃，发酵时间22 h，赤小豆与黄豆质量比为2∶8（即1∶4）。赤小豆纳豆与传统纳豆相比，不仅拉丝明显，保留了纳豆细腻润滑的口感，而且具有赤小豆鲜艳明亮的色泽和香糯可口的品质，其外观颜色饱满，品尝起来细腻绵软，氨味减少，香味增强，轻轻搅动时，黏液多，拉丝程度高，经测定，纳豆激酶酶活可达942 U/g。

在传统纳豆中添加赤小豆所得的赤小豆纳豆，其营养价值与口感均优于传统大豆纳豆，口味较符合国人的饮食习惯。赤小豆纳豆的研究与开发，不仅有利于提高赤小豆、大豆的附加值，使资源得到有效地利用，而且有助于人们在享受味蕾的同时改善饮食结构，增强国民体质，满足更多消费者的需求，为纳豆产业在中国的发展提供了新的思路。

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