响应面法优化白茅根总黄酮超声辅助提取工艺

李西腾，张佳佳，尹岚，郑楠

（江苏食品药品职业技术学院食品学院，江苏淮安223003）

白茅根为禾本科多年生草本植物白茅的根茎[1]，白茅根中含有三萜类化合物、苯丙素类化合物、有机酸类化合物、糖类、甾醇类、色原酮、黄酮类、内酯类，以及铁、铜、锌等矿物质，主要有止血、免疫调节、利尿降压、抑菌、抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、降血脂、降低羟自由基、抗氧化、改善肾功能等作用[2-7]。其中黄酮类化合物具有清除人体内自由基、改善血液循环、降低胆固醇等功效[8-10]。优化白茅根总黄酮提取工艺，对其药用开发与利用具有重要意义。目前，关于白茅根活性成分提取工艺的研究主要集中在多糖[11-13]、绿原酸[14-15]、总酚酸[16-18]、三萜类化合物等成分[18]，尚无利用响应面法优化超声提取白茅根总黄酮的工艺条件的研究报道。本研究选择乙醇体积分数、液料比、超声功率、提取时间等因素进行白茅根总黄酮提取工艺单因素试验，以响应面试验设计优化白茅根总黄酮提取工艺，为其开发应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白茅根：淮安市药材市场；芦丁标准品、乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司。

YB-2500A型高速多功能粉碎机：浙江永康市速锋工贸有限公司；SCIEENT型超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平：日本岛津公司；SHZ-DCⅢ循环水式真空泵：上海亚荣生化仪器厂；TU-1950紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 白茅根总黄酮提取

将白茅根于60℃烘干后粉碎过60目筛。称取样品1.0 g，加入乙醇溶液，置于超声波清洗机中提取，抽滤，滤液稀释后摇匀，作为待测液。

1.2.2 白茅根总黄酮测定方法

采取硝酸铝显色法[19-20]测定总黄酮含量。在510 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线，得回归方程：

y=7.744 6x+0.005 6，R2=0.999 2。根据回归方程，计算被测样液中总黄酮的含量。

式中：c为样品的吸光度代入回归方程计算得到的总黄酮浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液定容量，mL；m 为样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

以白茅根总黄酮提取量为指标，对影响白茅根总黄酮提取的各单因素进行研究。

乙醇体积分数：固定反应条件液料比25∶1（mL/g），超声功率400 W，超声处理30 min，考察不同乙醇体积分数对白茅根总黄酮提取量的影响。

液料比：固定反应条件乙醇50%，超声功率400W，超声处理30 min，考察不同液料比对白茅根总黄酮提取量的影响。

超声功率：固定反应条件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超声处理30 min，考察不同超声功率对白茅根总黄酮提取量的影响。

时间：固定反应条件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超声功率400 W，考察不同处理时间对白茅根总黄酮提取量的影响。

1.2.4 响应面试验设计

依据单因素试验，选取乙醇体积分数、液料比、超声功率和时间4个因素，黄酮提取量为响应值，通过Design Expert 8.0.6软件优化最佳提取工艺条件，具体设计如表1所示。

表1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对白茅根总黄酮提取量的影响

不同乙醇体积分数对白茅根总黄酮提取量影响的结果如图1所示。

图1 乙醇体积分数对白茅根总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由图1可知，当乙醇体积分数逐渐增大时，白茅根总黄酮提取量呈现出先增加后减少的趋势，当乙醇体积分数为50%时，提取到的总黄酮量较大，因此这里选择50%的乙醇体积分数。

2.1.2 液料比对白茅根总黄酮提取量的影响

不同液料比对白茅根总黄酮提取量影响的结果如图2所示。

图2 液料比对白茅根总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由图2可知，当液料比逐渐增加时，提取到的白茅根总黄酮的量呈现出先增加后减少的趋势，液料比25∶1（mL/g）时最多。由于增加液料比会稀释溶液，使得黏度得以降低，这对超声波的空化非常有利，因此能够增加提取量，然而，若料液比进一步增加，溶液体积增加将会导致机械效应以及空化作用减弱。所以，这里选择液料比 25 ∶1（mL/g）。

2.1.3 超声功率对白茅根总黄酮提取量的影响

不同超声功率对白茅根总黄酮提取量影响的结果见图3。

图3 超声功率对白茅根总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由图3可知，当超声功率逐渐升高时，提取到的白茅根总黄酮的量呈现出先增加后降低的趋势，当超声功率为500 W时，提取到的总黄酮的量较大，当超声功率继续增加时，总黄酮的提取量下降。因此，选择超声功率为500 W。

2.1.4 提取时间对白茅根总黄酮提取量的影响

不同提取时间对白茅根总黄酮提取量影响的结果见图4。

图4 提取时间对白茅根总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由图4可知，总黄酮的提取量随着超声时间的增加而增加，超过30 min降低。因此，选择30 min为适宜的超声时间。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验结果

响应面试验结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design Expert 8.0.6软件进行回归分析，得到白茅根中总黄酮提取量（Y）对乙醇体积分数（A）、液料比（B）、超声功率（C）和提取时间（D）的二次多项回归方程为：Y=2.18-0.012A-0.056B+0.10C-0.058D-0.056AB-0.11AC+0.022AD-0.068BC-0.024BD-0.029CD-0.13A2-0.20B2-0.23C2-0.15D2。

2.2.2 回归方程方差分析

方差分析结果见表3。

从表3可以看出模型Prob>F值小于0.000 1，表明该回归方程极显著，失拟项不显著，模型的相关系数R2为0.982 3，说明模型方程拟合程度好，可以用于黄酮提取试验的理论预测。

表3 回归方程系数显著性检验Table 3 Regression coefficients and their significance test

2.2.3 响应曲面分析及优化

响应曲面图见图5。

图5 各因素交互作用对白茅根总黄酮提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

除了乙醇体积分数，液料比、超声功率和提取时间对黄酮提取量的影响显著。两两因素之间对响应值均有一定的交互作用，其中AB、AC、BC之间的交互作用比较明显。由图5可知，该试验模型都能达到极值点，利用软件进行分析，发现白茅根总黄酮的最佳提取工艺如下：乙醇体积分数 48.50%、液料比 24.22∶1（mL/g）、超声功率529.47 W、提取时间28.93 min，此时的预测值为2.21 mg/g。为方便实际操作，采用乙醇体积分数50%，液料比 25∶1（mL/g），超声功率 530 W，提取时间30 min，在此优化条件下进行3次平行试验，结果为2.18 mg/g，将试验值与预测值相近，说明该回归模型与实际情况拟合较好。

3 结论

通过Box-Benhnken响应面优化并得到了提取白茅根总黄酮的最佳工艺条件：乙醇体积分数50%，液料比 25 ∶1（mL/g），超声功率 530 W，提取时间 30 min，实际提取到的白茅根总黄酮为2.18 mg/g，与理论预测值2.21 mg/g相近。说明采用响应面法优化白茅根总黄酮提取工艺具有可行性。试验发现超声辅助可以提高总黄酮的提取效率，还需要进一步探讨超声对其生物活性影响的相关性，以及白茅根总黄酮的抗氧化活性。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:99

[2]刘金荣.白茅根的化学成分、药理作用及临床应用[J].山东中医杂志,2014,33(12):1021-1024

[3]刘荣华,付丽娜,陈兰英,等.白茅根化学成分与药理研究进展[J].江西中医学院学报,2010(4):80-83

[4]李昌灵,张建华.白茅根提取物的抑菌效果研究[J].怀化学院学报,2012,31(11):34-37

[5]包永睿,王帅,孟宪生,等.白茅根水提物对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期及细胞凋亡的影响[J].时珍国医国药,2013,24(7):1584-1586

[6]李立顺,时维静,王甫成.白茅根化学成分、药理作用及在保健品开发中的应用[J].安徽科技学院学报,2011,25(2):61-64

[7]刘轩,张彬锋,侴桂新,等.白茅根的化学成分研究[J].中国中药杂志,2012,37(15):2296-2300

[8]杨文斌,罗惠波,叶光斌,等.溪黄草中黄酮类物质的提取工艺优化[J].食品研究与开发,2016,37(16):47-51

[9]P MladeěNka,L Zatloukalová,T Filipský,et al.Cardiovascular effects of flavonoids are not caused only by direct antioxidant activity[J].Free Radical Biology and Medicine,2010,49(6):963-975

[10]Mustafa R A,Abdul Hamid A,Mohamed S,et al.Total phenolic compounds,flavonoids,and radical scavenging activity of 21 selected tropical plants[J].Journal of Food Science,2010,75(1):C28-C35

[11]李粉玲,蔡汉权,邱永革,等.白茅根多糖的微波提取工艺研究[J].食品与机械,2009,25(2):137-140

[12]王海侠,吴云,时维静,等.白茅根多糖的提取与含量测定[J].中国中医药信息杂志,2010,17(2):55-57

[13]李容,梁榕珊,覃涛,等.白茅根多糖抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究[J].食品研究与开发,2014,35(7):9-12

[14]王莹,孟宪生,包永睿,等.白茅根水提物中绿原酸的含量测定[J].亚太传统医药,2011,7(3):22-24

[15]王海侠,姚青春,时维静,等.白茅根中绿原酸提取与含量测定[J].中国中医药科技,2010,17(4):331-332

[16]熊科元,陈石生,刘荣华,等.白茅根中两种主要酚酸成分的含量比较[J].中国医药指南,2010,10(2):72-73

[17]熊科元,刘荣华,陈石生,等.不同产地白茅根总酚酸的含量比较[J].时珍国医国药,2012,23(4):844-845

[18]李容,卢小雪,张德威,等.综合评分优选白茅根总酚酸和总三萜提取工艺[J].食品研究与开发,2013,34(24):77-80

[19]黎望,孙培冬,季晓彤,等.黄蜀葵花黄酮抗氧化性及对DNA氧化损伤的保护作用[J].食品与机械,2017,33(2):135-139

[20]于金跃,孙晶,李新华,等.响应面法优化水飞蓟茎中总黄酮的提取工艺[J].食品工业科技,2015,36(6):295-303