利用SSR标记技术鉴别玉米品种先玉696和先玉335的研究

2018-01-17张文兰段乃彬邓翠霞颜挺进

种子 2017年9期

李群，张文兰，田茜，段乃彬，戴双，邓翠霞，颜挺进

（山东省农作物种质资源中心，山东济南250100）

先玉696和先玉335都是铁岭先锋种子研究有限公司选育的国审玉米杂交种，具有高产、稳产、适应性广、熟期适中、株型合理、籽粒品质好、脱水快，出籽率高等优点，而先玉696更有着比先玉335抗倒伏、抗病性能高的优势，深受农民喜爱，推广面积逐年加大。

然而先玉696和先玉335有着相同的母本，不仅从种子外观上二者无任何差异（见图1），而且利用蛋白质电泳技术进行鉴别，由于蛋白质是基因经过转录后的次生产物，在对遗传基础相近的品种鉴定时具有一定的局限性［1］，同样也是无法区分先玉696和先玉335（见图2）。SSR分子标记技术广泛应用于品种鉴定和纯度检测研究中，具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、扩增稳定、引物序列易于交流，而且所需DNA数量少，质量要求不高，检测容易，重复性好等特点［13］。本实验是在已有的研究基础上，选取多态性、稳定性好、效率高的引物用于鉴别相似品种先玉335与先玉696，取得了良好的效果，以期为同行在工作实践中提供一个快捷的途径。

1 材料和方法

1.1 供试材料

先玉696和先玉335玉米杂交种，由本中心实验室提供。

1.2 SSR引物

根据《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY／T 1432—2014）［4］中提供的20对核心引物中选取了多态性高的phil 065 k 9玉米SSR引物。引物序列由上海博亚生物技术有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

提取技术采用 Weising等［5］研制的CTAB法并稍加改进。剪取25℃条件下发芽4 d的种子幼苗150 mg，置于1.5 m L离心管中，加入400μL DNA提取液［2% （W／V）CTAB，1.4 mol／L NaCl，20 mmol／L EDTA，100 mmol／L TrisHCl p H＝8.0，1%PVP］，磨碎，置于65℃水浴30 min。加入400μL 24∶1氯仿异戊醇（V／V），振荡混匀。室温下10 000 r／min离心5 min。将上清液200μL转入1.5 m L离心管，加入200μL冰冷乙醇沉淀DNA。10 000 r／min离心1 min，倒去上清液，加入500μL乙醇乙酸氨溶液（70%乙醇，10 mmol／L乙酸氨），离心收集沉淀（5 min，10 000 r／min）。加入100μL TE（p H＝8.0）溶解DNA［6］。

图1 先玉335与先玉696种子形态比较

图2 先玉334与先玉696蛋白质电泳图谱比较

1.3.2 DNA质量检测

分别对提取的DNA进行质量检测，取5μL DNA溶液在0.8%琼脂糖凝胶中电泳15 min，利用凝胶成像系统拍照记录［6］。

1.3.3 PCR扩增反应

PCR扩增反应采用25μL的反应体系，包括10 mmol／L TrisHCl，50 mmol／L KCl，3.0 mmol／L MgCl2，0.4μmol／L SSR 引物，0.25 mmol／L d NTP，1.0单位TaqDNA聚合酶，5μL DNA溶液。反应程序为：96℃，预变性2 min；94℃，45 s，55℃，1 min，72℃，45 s，反应35个循环；72℃，延伸2 min。PCR仪为Rapid Cycler（美国Idaho Technology公司生产）［6］。

1.3.4 扩增产物检测

采用多功能电泳仪（北京六一仪器厂生产）和与之配套的双垂直夹芯式电泳槽。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，160 V进行电泳，1 h结束。银染：1）固定：含10%乙醇和0.5%冰乙酸溶液中浸泡5 min；2）渗透：0.1%硝酸银溶液中浸泡10 min；3）漂洗：将胶片移入蒸馏水中洗涤3～5 s；4）显色：将胶片移入显色液（含1.5%NaOH和1%甲醛）中轻轻摇晃，直至显现出清晰谱带，即可终止显色，马上用流动的自来水冲洗胶片数分钟。

1.3.5 结果判定

参照《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY／T 1432—2014）进行判定。

2 结果与分析

2.1 玉米品种提取DNA质量检测的结果

DNA提取是SSR分子标记的基础，SSR标记对DNA的数量及质量要求不高［1］，即使部分DNA降解也能通过PCR反应扩增出来。将提取的DNA溶液于0.8%琼脂糖凝胶上检测，结果如图3所示，1～10各有1条清晰完整的亮带，尽管有部分有少量降解现象，但都能满足SSR鉴定玉米品种真实性的要求。

图3 先玉335和先玉696 DNA琼脂糖凝胶检测结果

2.2 引物的选用

引物是进行SSR分子标记的前提。选择适合的多态性高的引物可有效地提高工作效率，节省成本［6］。根据以往的工作经验，从《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY／T 1432—2014）中提供的20对核心引物中选取了编号为17的phil 065 k 9引物，如表1。

表1 引物的选用

2.3 扩增产物检测的结果

从引物phil 065对先玉335和先玉696扩增产物电泳结果（图2）可看出，在箭头所指处先玉696有2个位点与先玉335存在明显差异，上部位点的2条谱带比先玉335的距离稍近些，而先玉335的2条谱带的距离则稍宽些；在下部位点先玉696的2条谱带距离非常接近，而先玉335在同位点的2条谱带距离较远，由于先玉696与先玉335有着相同的母本，因此在这2个位点都有与先玉335共有的谱带，而由于父本不相同，因此在亲本共显的2条谱带中，显示出了父本谱带的不同。

根据中华人民共和国农业行业标准《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY／T 1432—2014）的判定标准，1）当品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；2）当品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；3）当品种间差异位点数＝0，判定为极近似或相同品种。本实验中由一对引物扩增后出现了2个位点的差异，可以很明确的判别先玉335与先玉696。

图4 先玉335和先玉696 DNA扩增产物检测结果

3 讨论

3.1 利用SSR分子标记技术鉴定品种真实性，引物筛选是关键。许多研究者做了大量的工作，在DNA提取、PCR反应程序、扩增产物的检测等环节中不断完善和优化［711］，但是对于适合的引物的筛选却是无法绕开的关键一步，常常要耗费大量的时间和财力。因此，选用多态性高的引物进行鉴定，可有效地提高工作效率，降低成本。在本实验中，根据以往的工作基础，仅选用一种多态性高、重复性、稳定性好的引物用于鉴别先玉335和先玉696，取得了较好的效果。

3.2 本实验采用8%非变性凝胶电泳方法检测扩增产物，较通常用的4.5%变性胶电泳［4］，程序步骤少，操作更为简单省力，其效果完全满足实验要求，实用性更利于一般种子检测实验。

3.3 少数骨干自交系的频繁使用导致我国玉米杂交种的遗传基础渐趋狭窄，很多杂交种的生物学特性非常接近，使判别不同杂交种变得十分困难［12］，仅用生化技术进行品种鉴定已经无法涵盖不断涌现的新品种，而SSR分子标记技术则可以弥补这一遗憾，不仅可以鉴别品种的真实性，进而可以检测种子的纯度。

［1］辛景树，郭景伦，贾希海.SSR技术在玉米种子纯度鉴定上的应用［J］.种子科技，2005（3）：155157.

［2］中华人民共和国农业行业标准NY／T 449—2001玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法［M］.北京：中国标准出版社，2001.

［3］李汝玉，杨平平，宋国安.简单重复序列（SSR）及其在品种鉴定及种子检测中的应用［J］.种子，1999，18（5）：3335.

［4］中华人民共和国农业行业标准《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY／T 1432—2014）.

［5］Weising K，Nybom H，Wolff K，et al.DNA Fingerpringting in Plants and Fungi［M］.CRC Press Inc.，1995：5155.

［6］李群，李汝玉，颜廷进，等.应用SSR标记技术鉴定登海11号玉米杂交种纯度的研究［J］.种子，2004，23（10）：2123.

［7］郭奕生，何德银.SSR分子标记在玉米品种真实性鉴定上的应用［J］.广东农业科学，2014（12）：1215.

［8］曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米SSR分子标记技术操作流程研究进展［J］.中国农学通报，2012，28（15）：14.

［9］任敬雯.SSR标记及其在玉米中的应用［J］.安徽农学通报，2011，17（11）：5558.

［10］李葱葱，刘娜，李飞武，等.一种快速提取玉米基因组DNA的方法［J］.玉米科学，2011，19（1）：5255.