北柴胡新品种川北柴1号组织培养快繁初步研究

余 马，左文松，刘 茹，徐冬梅，舒晓燕，唐志康，侯大斌

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳621010； 2.泸州市古蔺县农业局，四川 泸州646500）

柴胡（Radix Bupleuri）为我国、日本和韩国等亚洲国家使用的常用大宗药材。该药材常同其他药物结合治疗感冒发热、寒热虚劳发热、小儿痘疹余热、腹部膨大、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱落及月经不调等症［12］。目前，柴胡已被纳入中国和日本国家药典，同时在中国和韩国被世界卫生组织列为常用药用植物［34］。因为其重要的药用价值，柴胡需求量急剧增加。在中国，柴胡年均需求量已过8 000 t；在日本市场2002年售出含有柴胡的处方药总额达到270亿日元［56］。近年来，野生柴胡的资源蕴藏量由于掠夺式开采急剧下降，且野生柴胡资源存在来源地不明和种质混杂导致药效不稳定及药材市场混乱的弊端，因此工业化柴胡栽培生产显得尤为重要。

目前柴胡规模化栽培采用种子直播方式。与主要作物相比，柴胡驯养历史较短，很多性状不利于标准化生产种植，特别是柴胡种子萌发时对土壤水分含量非常敏感，在田间萌发率低和出苗不整齐等问题严重阻碍柴胡大规模栽培。此外，柴胡为异花授粉植物，后代产量性状和有效成分变异概率较高［7］。组织培养可以在短时间内大量获得性状一致的植株，为工业化次生代谢产物生产提供材料基础。且柴胡资源搜集工作中，植株移栽不易成活。高雨量地区柴胡授粉结实较少，搜集难度极大，亟待开发系统的柴胡组织培养体系，为柴胡资源搜集工作提供技术保障。本研究以北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）新品种川北柴1号为材料。对其进行不同生长激素的丛生芽诱导及不定根诱导实验，以期探索出适宜北柴胡快速繁育的组织培养体系，为柴胡新资源搜集工作提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究采用的主要研究对象为北柴胡新审定品种川北柴1号。该品种系中国医学科学院药用植物研究所、四川德培源中药科技开发有限公司、四川农业大学农学院及西南科技大学生命科学与工程学院共同选育。供试植株于2014—2015年种植于四川德培源中药科技开发有限公司安县花罧基地。田间设计采用撒播，种植密度为2 000株／hm2，常规肥水管理及病虫害防治。

1.2 北柴胡丛生芽诱导

以北柴胡未拔节的幼嫩茎段为外植体。外植体消毒条件为：带叶茎段取样后去掉叶片，流水冲洗2 h。取出茎段后70%乙醇消毒50 s，0.1%升汞消毒10 min后灭菌水清洗10次。以MS培养基为基本培养基，每升培养基添加6 g琼脂粉和30 g蔗糖，p H值控制在5.8～6.0。采用6BA、KT、NAA、IAA 4种调节激素，每种激素设置3个浓度水平（表1）。各激素间协同效应采用正交设计试验（表2）。单因素试验及正交设计试验均设置不添加生长激素的空白对照组。设置3次重复。光照培养箱培养条件设置为：培养温度（25±1）℃，光照强度2 000 lx，日光照时间14 h。外植体培养30 d后进行性状考查。

1.3 柴胡不定根诱导

从诱导的丛生芽中切取长势均匀一致的单个芽为外植体。以1／2 MS培养基为基础培养基，琼脂粉、蔗糖浓度及p H值同丛生芽诱导试验一致。采用NAA、IBA和IAA 3种调节激素，每种条件设置3个浓度（表3）。各激素间对不定根诱导的协同效应采用正交设计试验（表4）。单因素试验及正交设计试验均设置不添加生长激素的空白对照组。设置3次重复。培养条件同丛生芽诱导试验一致，不定根诱导培养30 d后进行性状考查。

表1 丛生芽诱导实验中的激素及浓度

表2 不定根诱导实验中的激素及浓度

1.4 性状考查

丛生芽诱导实验考查性状包括：丛生芽个数、芽长、叶绿素、鲜重、干重。不定根诱导实验考查性状包括：支根数、根长、叶绿素含量、节长、鲜重、干重。

1.5 统计分析

方差分析采用SPSS 16.0分析软件。

2 结果与分析

2.1 丛生芽诱导

图1 单因素诱导柴胡丛生芽

不添加任何激素对照的柴胡外植体生长3 d后，仅长出极少不定芽。6BA、KT、NAA、IAA 4种激素的不同水平对诱导川北柴1号丛生芽均具有显著正向效应（p＜0.05，表3）。各因素的3个浓度水平诱导柴胡丛生芽，芽个数、芽长、鲜重和干重、叶绿素含量的差异较大。综合各性状的测定结果，诱导柴胡丛生芽增殖效果的最佳6BA浓度为1.0 mg／L，其诱导不定芽个数达到7个，所诱导不定芽的芽长、鲜重、干重及叶绿素含量均显著高于0.5 mg／L 的6BA、1.5 mg／L 的6BA和空白对照诱导结果（图1）。诱导丛生芽效果的最佳KT浓度为0.5 mg／L，该浓度处理下诱导出7个不定芽，其诱导不定芽鲜重、干重及叶绿素含量显著高于对照。诱导丛生芽效果的最佳NAA浓度为0.2 mg／L，该浓度处理下诱导出7个不定芽，其诱导不定芽的所有考查性状皆高于对照。诱导丛生芽效果的最佳IAA浓度为1.0 mg／L，其诱导不定芽鲜重和干重显著高于对照，芽长和叶绿素含量与对照差异不明显。

表3 植物生长激素对丛生芽诱导的影响

2.2 不定根诱导

不定根诱导试验中，剥离不定芽在不添加任何生长激素的1／2 MS培养基中长势很弱，其生长30 d后未长出不定根，且叶片变细弱，其叶绿素含量仅为4.3。NAA、IBA、IAA 3种激素的不同水平对诱导川北柴1号不定根均具有正向效应（表4）。各因素的3个浓度水平诱导柴胡不定根，根个数、根长、根鲜重和干重、叶绿素含量的差异较大。其中NAA诱导试验中，0.1 mg／L浓度NAA诱导不定根数达到45，除不定根平均根长外，其诱导不定根其余性状皆显著高于0.3 mg／L和0.5 mg／L浓度NAA诱导结果。IBA诱导试验中，1.0 mg／L浓度IBA诱导不定根数达到34，除根长与0.5 mg／L浓度IBA诱导效果差异不显著外，其余考查性状皆显著高于0.1 mg／L和0.5 mg／L浓度IBA诱导效果。IAA诱导试验中，1.0 mg／L浓度IAA诱导不定根数量最多，达到18个，显著高于0.1 mg／L和0.5 mg／L浓度IAA诱导结果。

表4 植物生长激素对不定根诱导的影响

3 讨论与分析

柴胡是常用大宗药材，因此柴胡属植物的组培相关报道较多。Fraternale等［7］研究并报道了诱导三岛柴胡（B.fruticosum）芽增殖和不定根生长的组培体系。Chen等［8］建立提升高氏柴胡（B.kaoi）芽诱导系数的组培体系，并对组培过程中小苗抗性提升做了系统研究。北柴胡是《中华人民共和国药典》2015版一部规定正品柴胡，因此关于北柴胡组培研究的报道也较多。Hao等［9］建立了北柴胡愈伤组织诱导体系。Yao等研究表明，在黑暗条件下利用IAA诱导北柴胡愈伤组织可以产生大量不定根［10］。Hao等［11］通过控制蔗糖浓度及添加时间等方式建立了可以产生大量北柴胡不定根的半连续组培体系。对我国山西、甘肃和陕西等北方柴胡产区收获北柴胡的组织培养研究发现，各产区收获北柴胡组织培养条件存在特异性，因此探索适应特定柴胡基因型的组织培养体系非常必要［12］。

四川省青川县马公及周边地区野生柴胡资源丰富，分布较广，已有300多年种植历史，是柴胡的著名道地产区。川北柴1号系四川首个北柴胡审定新品种，该品种在多年多点区域试验中较四川地方栽培种及中国主要柴胡品种中柴1号表现出显著产量及药效品质。目前川北柴1号在四川推广面积达330 hm2以上，生产用种供不应求，亟需开展适应该品种的组织培养体系以满足生产制种需要。

本研究通过不同种类及浓度的生长激素研究表明：在 MS培养基中，1.0 mg／L的6BA，0.5 mg／L的 KT，0.2 mg／L的NAA和1.0 mg／L的IAA在显著促进不定芽增殖的同时，还能最大化促进不定芽生长；在1／2 MS培养基中，0.1 mg／L浓度 NAA，1.0 mg／L浓度IBA 和1.0 mg／L浓度IAA对柴胡不定根生长促进作用最佳。为研究各生长激素间协同效应，本课题组在丛生芽诱导试验及不定根诱导试验中针对所有供试生长激素进行了3个浓度水平的正交设计实验。但可能实验重复数（重复设置为3）过低，各生长激素贡献效应并不显著，因此更大规模的组织培养试验正在进行中。本研究已获得的组培体系中，芽增殖系数每30 d即可达到1∶9，一年即可达到1∶2.8×1011，本研究对川北柴1号生产推广制种具有重大意义。

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