含缬氨酸蛋白p97与宫颈癌相关性的研究进展

杨文艳 ，贺桂芳 ，卞美璐

（1.北京大学医学部，北京 100191；2.中日友好医院 妇产科，北京 100029）

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，在宫颈癌细胞也观察到了p97蛋白阳性表达升高。随着近年来对其深入研究，p97蛋白成为肿瘤治疗的新靶点，研究表明，含缬氨酸蛋白p97与多种恶性肿瘤的发生发展、远处转移及预后相关，p97蛋白参与众多生理病理过程，主要通过清除细胞内的异常蛋白质，控制蛋白质质量，维持正常细胞及肿瘤细胞存活[1，2]。p97抑制剂在治疗妇科恶性肿瘤方面有其独特的应用。本文就p97蛋白与宫颈癌的相关性研究进展进行综述，以期为宫颈癌的预防和治疗提供更多参考。

1 含缬氨酸蛋白p97的概述

1.1 p97蛋白结构

1982年，Moir等人首次描述了p97蛋白的酵母变异株，并认为其失活后导致细胞周期停止在G2-M期，在哺乳动物体内存在同源蛋白，因其分子量为97kDA，命名为p97蛋白或含缬氨酸蛋白[1]。随后，在秀丽隐杆线虫体内发现p97同源基因CDC-48.1和CDC-48.2，而在人类、鼠类和酵母等生物体内则是单个基因，在人体内，编码p97蛋白的基因位于染色体9p13-p12，有报道前体B淋巴细胞转录因子是调节p97基因转录的关键因子[2]。

p97蛋白是一种同质六聚体，每个单体有1个N域和2个ATP酶域：D1域和D2域。低温电子显微镜下观察到，当D1域与ATP结合时，N域向上旋转形成 “上方构象”，有利于N域与辅助因子结合，如与Ufd1/Npl4复合体形成泛素链底物结合位点，暴露的D2酶域增强ATP酶活性，ATP酶水解促使底物通过蛋白中心孔[3]。

1.2 p97蛋白功能

p97蛋白属于ATP酶家族，它广泛存在于人体各种细胞内，具有控制蛋白质质量、调控基因表达、调节转录活性、介导膜融合、参与细胞周期控制等多种功能。p97蛋白的功能依赖于结合不同的蛋白质辅助因子，例如，p97结合Npl4/Ufd1调节泛素蛋白酶系统，p97蛋白结合UBXD1主要影响溶酶体功能，p97结合p37主要发生在内质网、高尔基体上[4]。

p97蛋白介导降解异常蛋白控制细胞内蛋白质质量：（1）p97介导胞内错误折叠蛋白质泛素化，并协助其通过脂质双分子层，由内质网转运到蛋白酶体，完成内质网相关的蛋白降解；（2）有缺陷的mRNA翻译产生异常多肽，底物泛素化，泛素化底物与p97蛋白结合，提取异常多肽至溶酶体降解；（3）p97结合线粒体外膜异常多肽，促进线粒体相关的降解，维持线粒体内蛋白质稳态；（4）p97参与细胞自噬，当线粒体受损时，p97与Ufd1/Npl4被招募到线粒体表面，通过细胞自我吞噬清除线粒体，具体机制可能与蛋白 Vmsl、Ufd3 有关[1]。

另外，p97调控基因表达，p97通过泛素蛋白酶系统降解小抑制蛋白质IκB，提高NFκB活性。p97能够从染色质中提取不同的泛素化蛋白，协助复制，p97与Ufd1结合将Ku环从DNA链上移除，还与泛素连接酶RNF138协同诱导无错同源重组，控制修复的精准度[6]。

2 p97蛋白与宫颈癌

2.1 p97蛋白与宫颈癌的发生发展

研究发现正常宫颈组织、CIN2/CIN3、宫颈癌组织中p97蛋白含量具有统计学差异，在绝大多数正常组织中低表达，在CIN2/CIN3及宫颈癌中高表达，进一步采用免疫组化方法证实，p97蛋白在宫颈癌的阳性表达明显高于正常组织[7]，这表明p97蛋白的表达升高可能与宫颈癌的发生有关。

有报道采用可逆性p97蛋白抑制剂N2，N4-二苯基喹唑啉-2，4-二胺（DBeQ）作用于宫颈癌细胞（HeLa），细胞中p97蛋白耗尽时，细胞核和膜丰富的区域聚集大量转录因子，肿瘤细胞凋亡[2]。在正常组织细胞内，p97蛋白介导泛素蛋白酶系统及时清除异常蛋白，控制细胞内蛋白质质量，在癌细胞内，由于细胞周期加快，蛋白质的合成速度也非常快，产生的“残次品”也越多，癌细胞的生长和存活更加依赖p97蛋白来进行蛋白质的“质量控制”，抑制p97蛋白诱发肿瘤细胞内异常蛋白堆积，导致肿瘤细胞死亡，提示p97蛋白对宫颈癌细胞生存有着重要作用。

2.2 p97蛋白与宫颈癌复发转移

关于p97蛋白在恶性肿瘤复发转移过程中的分子机制研究，有报道使用siRNA干扰p97蛋白表达或者应用p97蛋白抑制剂EeyarestatinI（EerI）能促使细胞发生内质网应激和上皮细胞间质转型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）样改变[9]。EMT是指上皮细胞丢失表面标记物获得间叶细胞表面标记物，是肿瘤发生侵袭的重要机制。细胞内异常蛋白质不及时清除导致内质网应激，内质网应激可通过多种通路促使EMT，例如，在肺泡上皮细胞中的MAPK、Smad及β-连环蛋白。

p97蛋白调节NFκB活性参与细胞增殖、抗凋亡过程，NFκB正性调节细胞因子IL-6、IL-8、VEGF，影响肿瘤血管生成，NFκB还可活化MMP9和尿激酶样纤溶酶原激活剂，后两者与肿瘤细胞远处转移密切相关。

研究报道，p97蛋白与多种恶性肿瘤的远处转移有关。国外报道170例肝癌组织中，p97蛋白高表达的肝癌患者具有较高的门静脉侵犯潜能（P＜0.01），国内13例肝细胞癌肉眼癌栓和镜下肝细胞癌栓的病例中12例（92.3%）p97阳性表达。非小细胞肺癌浸润转移组中p97蛋白的阳性表达率为90%（18/20）、非转移组52%（21/40），差异具有统计学意义（P=0.002）[10～12]。14 例发生远处转移的骨肉瘤组织中p97蛋白高表达11例 （78.6%），46例无转移的骨肉瘤组织中p97高表达15例（32.6%），二者统计学差异显著（P=0.01）[13]。检测421例乳腺癌肿瘤组织中和正常乳腺组织p97蛋白含量，发现两者具有统计学差异（P＜0.01），随访结果显示p97蛋白高表达导致乳腺癌患者低生存率[14]。p97蛋白低水平表达的前列腺癌患者5年生存率明显高于p97蛋白高水平表达者，并且p97蛋白水平与血清PSA水平呈正相关，血清PSA是目前预测前列腺癌复发转移的主要指标，PSA＞20ng/ml在p97蛋白低表达者占25.8%，在p97蛋白高表达者占67.7%[15]。目前，尚无p97蛋白与宫颈癌远处转移的报道，其与宫颈癌复发转移的相关性有待进一步研究。

2.3 p97蛋白与人乳头瘤病毒（HPV）感染

高危型HPV持续感染并整合到宿主细胞染色体上是宫颈癌发生的关键，当病毒入侵时，宿主细胞通过启动凋亡程序抑制病毒增殖。HPV E6蛋白与泛素连接酶结合，诱导p53泛素化并被溶酶体降解，抑制细胞凋亡；HPV E7蛋白与Rb结合，促进宿主细胞进入S期，促进细胞有丝分裂。有研究报道[16]，p97启动子与HPV的转化有关，在宫颈癌细胞中，p97启动子上调HPV16 E6/E7 mRNA和蛋白的表达，并且p97通过E6-E6 APPTPN3通路调控HPV E6基因表达。

有学者采用RT-qPCR技术[17]，研究23例CIN2和CIN3、16例子宫颈鳞癌标本p97与p14转录差异，证实在宫颈癌和高级别上皮内瘤变组织中，P14转录明显低于p97转录，但两者在上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达均具有统计学差异，提示p97启动子控制大部分HPV病毒早期基因的转录。另一项研究利用免疫组化的方法，分析p97蛋白在口咽鳞癌组织中表达差异性，发现p97蛋白高表达的HPV阴性患者的5年生存率明显高于p97蛋白低表达者，而HPV阳性患者5年生存率与p97蛋白表达不相关。进一步采用qPCR分析15例HPV阴性口咽癌细胞，具有9p13-p12区域的细胞p97表达明显高于缺失此区域的细胞，而HPV阳性口咽癌患者中，9号染色体的缺失与较好的预后相关，在HPV阴性患者中9号染色体的缺失预后更差[18]，而p97基因位于9号染色体上。提示9p13-p12区域的丢失、p97 mRNA转录减少、蛋白表达降低和HPV阴性口咽癌不良预后有直接相关性。

3 p97蛋白抑制剂与恶性肿瘤治疗

3.1 p97蛋白抑制剂的研究

p97蛋白参与多种病理生理过程，与肿瘤的发生发展及预后相关[19]，p97蛋白抑制剂作为抗肿瘤药物具有良好的临床应用价值。人工合成p97蛋白抑制剂EerI，它主要针对p97蛋白D1域ATP水解功能，但不具有特异性。研究证实EerI主要通过聚集多泛素化蛋白、抑制内质网相关的蛋白降解、诱发内质网应激和细胞凋亡等途径抑制p97蛋白功能，在体外，EerI有明显的肿瘤杀伤活性，它能增强蛋白酶体抑制剂Bortezomib的杀伤宫颈癌细胞作用[20]，这提示我们p97蛋白有望成为新的抗肿瘤靶点。

近年来，对p97蛋白抑制剂的研究更加深入，DBeQ是一种可逆性抑制p97蛋白化学制剂，它特异性作用于p97蛋白D2域，具有较高的杀伤宫颈癌细胞活性[8]。其中最有名的可逆性p97蛋白抑制剂是CB-5083，它选择性作用于D2域，竞争性抑制ATP酶活性，具有良好的口服生物利用率。实验证实，无论是实体细胞肿瘤还是血液系统肿瘤，在异种肿瘤移植的小鼠体内，CB-5083能持续发挥抗肿瘤活性，目前，CB-5083的研究已经进入Ⅰ期临床试验阶段[21]。

然而，上述人工合成的p97蛋白抑制剂作为抗肿瘤药物进入临床带来了新的问题：肿瘤细胞产生抗药。学者探讨肿瘤细胞产生抗CB-5083的分子机制[22]，采用卵巢癌细胞接受较高浓度CB-5083处理方法，获得抗药性比母系高5～6倍的卵巢癌细胞，分析p97编码序列的基因组和互补DNA序列发现：（1）密码子470的错义突变导致p97蛋白ATP酶活性增强；（2）密码子606或密码子616的无义突变或者移码突变导致特异等位基因沉默。这些与卵巢癌细胞抵抗p97蛋白抑制剂有关的突变可能有利于临床试验中寻找潜在的辅助标记物，针对p97突变点的靶向治疗有助于提高p97抑制剂抗肿瘤效果，p97蛋白抑制剂有望成为抗肿瘤治疗方案之一。

研究发现，长期持续服用戒酒药双硫仑的乳腺癌患者，相比于没有使用双硫仑的患者，死亡率降低了34%[23]。临床随机对照研究发现，加用双硫仑药物治疗晚期非小细胞肺癌相比单纯化疗，患者生存时间延长10～7.1个月[24]。最近，Nature杂志首次揭示了双硫仑代谢产物二硫代氨基甲酸酯-铜复合体（diethyldithiocarbamate-copper complex，CuET）是发挥抗肿瘤作用的主要物质，CuET主要作用于p97-NPL4介导的泛素蛋白酶体降解途径，抑制p97蛋白功能，使癌细胞内积累大量的残次蛋白，诱发热休克反应，最终导致癌细胞的凋亡[25]。p97蛋白成为抗肿瘤研究的热点。

3.2 p97蛋白抑制剂在宫颈癌治疗中的应用

目前，宫颈癌的治疗主要是手术治疗和放射治疗，手术治疗仅适用于Ⅰa～Ⅱa期患者，其效果受患者临床分期、年龄、全身情况、设备条件及医疗技术水平影响，手术属于有创操作，术中术后并发症多，如脏器损伤、出血、输尿管瘘、膀胱阴道瘘、淋巴囊肿及术后感染等，严重影响患者婚姻质量和生命质量。放疗是治疗妇科恶性肿瘤的常用手段之一，当手术切除范围不够、手术有可疑局部残存且该肿瘤具有放疗敏感性时，可行术后辅助性放疗，放疗的不良反应多，包括骨髓抑制、纳差、腹泻、泌尿系不适等，降低患者生命质量，影响患者依从性。基于双硫仑具有抗肿瘤作用的研究，有学者研制含有双硫仑药物的阴道环剂治疗宫颈癌[26]，采用乙烯-醋酸乙烯酯共聚物材料，双硫仑稳定性良好，并且能可控性地释放使其维持在宫颈癌HeLa细胞半抑制率以上的浓度进一步。也有学者研制双硫仑阴道片，双腔阴道片在体外释放持续释放双硫仑，Elvax 40阴道制剂超过14天仍每天释放15.4μM双硫仑，使其浓度达宫颈癌细胞半抑制率的2500至3500倍[27]。提示p97蛋白抑制剂可能为宫颈癌的治疗提供新的途径。

4 展望

p97蛋白是细胞众多病理生理过程中重要的调控分子，与恶性肿瘤的发生发展、预后密切相关，目前对p97蛋白作用机制的研究取得了很大进展，但其对宫颈癌病情发展、预后评估的作用机制尚不清晰，仍需进一步研究。对p97蛋白的清除细胞内异常蛋白控制细胞内蛋白质质量及细胞凋亡作用、参与HPV早期感染的深入研究，有助于推动p97蛋白抗宫颈癌靶点作用机制的研究，在基因靶向治疗宫颈癌方面具有良好前景。