多基因检测在综合性医院分枝杆菌分型中的临床应用
2018-12-20贾红兵周诚君
杨 辉，贾红兵，李 江，周诚君，王 靖
（中日友好医院 检验科，北京 100029）
分枝杆菌已报道150余种[1]，除了麻风分枝杆菌 （mycobacterium，leprae）和结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）） ，其余统称为非结核分枝杆菌 （non-tuberculous mycobacterium，NTM）。NTM肺病与结核病有着类似的临床表现，常被误诊为肺结核。近年来，NTM的分离率和发病率呈上升趋势[2]。以分枝杆菌培养及抗酸染色镜检为基础的传统方法不能有效区分MTB与NTM。另外，诺卡菌属易与NTM混淆[3]。
DNA测序是核酸诊断的“金标准”，随着成本降低，测序将成为微生物核酸检测的常规选项。16S rDNA是是细菌分类研究中最常用的靶序列。分枝杆菌rpoB基因编码RNA聚合酶β亚基，与hsp65（heat shock protein 65）基因一起作为靶基因在分枝杆菌型属鉴定中得到广泛应用[4，5]。本研究旨在利用核酸检测技术，筛查综合性医院临床分离的分枝杆菌并鉴别菌种。使用16S rDNA基因来筛查分枝杆菌，我们使用rpoB基因来鉴定分枝杆菌菌种，以hsp65基因进行复核。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
2015年10月～2016年9月，我院需诊断或除外肺结核的患者留取痰样本4467份，排除重复检测，关联至就诊者2236例，其中抗酸阳性者40例。经改良L-J培养基37℃培养2～8周，菌落涂片经萋-尼氏染色，镜检阳性的菌落经16SrDNA测序排除诺卡菌及其他非目的菌，获得32例分枝杆菌临床分离株。
1.1.2 主要试剂和仪器
改良罗氏培养基购自济南赛尔生物公司；Blend Taq plus DNA聚合酶购自日本Toyobo公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；溴化乙锭购自美国Sigma公司；ABI 9700 PCR仪购自美国应用生物信息公司；Gel Doc 2000凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA样本制备
参考万康林团队的研究文献[6]，在生物安全柜中用接种环刮取细菌，置于100μl的TE液中混匀，金属浴 80℃灭活 60min，100℃加热 30min，立即置于冰上2min，12000r/min离心3min，移上清置-20℃冻存备用。
1.2.2 DNA扩增及测序
参考前人的研究方法[3，6，7]，比较核酸诊断分枝杆菌的种属特异性保守序列，选择16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因作为本研究的靶序列，PCR引物由上海生工公司合成（见表1）。PCR反应体系为 30μl，取 10×含镁的缓冲液 3μl，2.5 mmol/L 的 dNTPs （dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP）3μl，10μmol/L 引物各 3μl，模板 DNA 3μl，Blend Taq plus DNA聚合酶1U，最后加灭菌水至终体系30 μl。PCR 循环参数：94℃预变性 5min，94℃变性30s，60℃ 延伸1min，共反应35个循环，最后72℃ 延伸 5min。扩增后取5μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙锭（EB）染色10min，并在凝胶成像系统上观察分析。
1.2.3 PCR产物测序分析
PCR产物由北京睿博生物公司进行测序。16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因3个靶序列信息上传 NCBI 网站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），进行同源性比较分析。序列同源性＞97%者即可确定菌型。
2 结果
2.1 菌株筛选
2015年10月～2016年9月，中日友好医院微生物实验室L-J培养基分离菌落149株，萋-尼氏抗酸阳性者经16S rDNA测序确认为分枝杆菌32株，均分离自不同的临床患者痰样。
表1 引物序列
图1 rpoB与hsp65 PCR产物测序前电泳
2.2 分枝杆菌分型
32株分枝杆菌核酸扩增完成后，产物电泳确认（见图1），经rpoB基因序列分析，包括结核分枝杆菌22株，分离率为68.8%，非结核分枝杆菌10株，分离率为31.2%。10株NTM菌株中，包括脓肿分枝杆菌4株，胞内分枝杆菌3株，海分枝杆菌1株，龟分枝杆菌1株，产黏液分枝杆菌1株。hsp65基因测序结果与rpoB基因测序结果完全一致。
3 讨论
肺结核初诊初查大多是由综合性医院完成，但是因为生物安全或结核专力量不强等原因，综合性医院实验室分枝杆菌鉴定分型方法未能普遍开展，导致综合性医院分枝杆菌研究相对稀缺。如果预先对样本进行菌体灭活，然后提取核酸可以减少生物危害，所以应用相对安全的核酸诊断技术，可成为综合型医院今后结核病筛查、诊疗工作的重点之一。
本研究使用了rpoB基因与hsp65基因进行分枝杆菌菌种鉴定，结果完全一致，但hsp65基因扩增效率较低，其中5株菌进行了二次PCR扩增。其原因可能与我们的核酸样本制备的方法有关。考虑到湿热容易使分枝杆菌灭活，操作须在安全柜内操作，所以我们使用了最简易的生物安全柜内热裂解法。这样制备的DNA比较破碎，hsp65基因PCR产物片段大，完整的核酸模板数量少，扩增效率低于rpoB基因。
本研究分支杆菌的NTM分离率为31.2%，远高于国内同时期结核病专科医院的研究数据，福州肺科医院 NTM 分离率为 10.2%（649/6362）[6]，上海肺科医院NTM分离率为 10.8%（95/877）[7]，新疆自治区胸科医院NTM分离率为4.98%（183/3674）[8]，沈阳市胸科医院NTM分离率为1.87%（72/3847）[9]，重庆公卫医疗救治中心NTM分离率为10.23%（58/567）[10]。数据的差异与分支杆菌的地理分布和实验室检测手段有关[11，12]，但现行的结核病防治模式也会对之产生影响。因此在综合医院提高分枝杆菌检测水平，是规范结核病诊疗的重要环节。
