远隔缺血处理对慢性脑灌注不足的神经保护作用研究

尤久琳， 陈姝娜， 高 斌， 解婷婷综述， 冯加纯， 马 迪审校

越来越多的研究关注缺血处理(ischemic conditioning)对急性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。根据处理的时间不同，缺血处理分为缺血前处理(ischemic pre-conditioning)、缺血过程中处理(ischemic per-conditining)和缺血后处理(ischemic post-conditioning)，分别在脑缺血事件发生前、发生过程中或发生后对脑组织进行一系列短暂的阻断血流/再灌注，以激活多种内源性保护机制，减轻脑组织损伤。由于其临床应用受到对脑实施额外缺血风险的限制，近些年来，缺血处理的概念扩大至远隔缺血处理(remote ischemic conditioning，RIC)，通过袖带加压阻断肢体血流之后再复流，可以反复多个循环，也能发挥对脑组织的保护作用。由于RIC的无创性，而且肌肉组织对缺血的耐受性较好，已经由临床试验证实对急性脑缺血是有效的[1]。理论上讲，RIC对慢性脑灌注不足的患者同样应该有效，并已经被研究证实[2，3]，然而相关的研究数量较少，而且关于RIC在慢性脑灌注不足过程中发挥保护作用的机制尚不完全清楚。作为一种低成本、低风险、无创性、易实施的方法，RIC在慢性脑灌注不足中的应用以及相关的神经保护机制值得总结及探究。

1 慢性脑灌注不足引发的病理生理过程

慢性脑灌注不足已被认为是血管性痴呆的危险因素，且能够加速阿尔茨海默病患者的认知衰退。大量证据表明，慢性脑灌注不足可导致认知功能障碍[4]，其潜在的神经生物学机制包括：(1)加速β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集；(2)诱导中枢神经系统炎症；(3)引起谷氨酸的兴奋毒性；(4)促进神经细胞凋亡；(5)自噬障碍等。

2 RIC可以抑制中枢神经系统Aβ的聚集

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理改变是Aβ聚集以及形成老年斑，Aβ是β淀粉样蛋白前体(APP)被β-和γ-分泌酶水解产生的[4]。据报道，慢性脑灌注不足可以加速Aβ在脑中的沉积并聚集。双侧颈总动脉狭窄(bilateral carotid artery stenosis，BCAS)模型诱导的慢性脑灌注不足，可以使大脑皮层中Aβ的形成增加并诱导其在细胞内的沉积[5]。慢性脑灌注不足不仅可以引起Aβ在神经元的沉积，还可引起在小动脉壁的沉积，导致脑血管病变，使脑血管壁增厚、脆性增加及管腔狭窄，既可以引起脑血流灌注不足，也可以引起梗死和出血[6]。

Khan等在C57/B6雄性小鼠中通过BCAS模型诱导慢性脑灌注不足。20只小鼠随机分为3组，假手术组，BCAS组，BCAS+RIC组。RIC在BCAS造模后1 w施行，每天1次持续治疗2 w。在BCAS造模后4 w进行认知测试，并取脑组织进行生物化学检测。组织学显示，未予以RIC的，Aβ在额叶皮层和海马中明显增多；而RIC处理后，Aβ明显减少，也明显改善了认知功能[1]。

3 RIC可减轻中枢神经系统的炎症反应

慢性脑灌注不足诱导脑组织发生炎症反应，包括星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，以及淋巴细胞等外周免疫细胞向中枢神经系统的侵入[6，7]。在慢性脑灌注不足模型动物的脑组织中可以发现：小胶质细胞的MHC I类分子、MHC II 类分子、白细胞共同抗原、CD11b、Iba1[8]的表达上调，和星形胶质细胞数量增加，表明二者被激活；多种外周免疫细胞向脑组织浸润，例如CD4+及CD8+的T淋巴细胞出现在白质、大脑皮层以及丘脑和海马的灰质中[7]，MPO阳性的中性粒细胞也在脑组织浸润[9]。小胶质细胞和星形胶质细胞被激活后可以产生细胞毒性物质、趋化因子及TNF-α、IL-1β等细胞因子，加重脑组织损伤[10]，侵入中枢神经系统的外周免疫细胞，例如来源于单核细胞的巨噬细胞，能够释放谷氨酸并通过激活周边的神经元上的谷氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)发挥神经毒性作用[11]；CD4+T细胞可产生TNF-α等多种细胞因子[12]；CD8+T细胞直接通过其介导的细胞毒性作用对神经元产生损伤。除脑实质的炎症反应外，血管炎症反应的标志物ICAM-1 和VCAM-1的表达也出现上调[8]。

已有研究发现，RIC可以抑制慢性脑灌注不足引起的血管炎症反应以及星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，下调ICAM-1和VCAM-1在mRNA水平的表达，也使星形胶质细胞的标记物GFAP和小胶质细胞标记物Iba1在蛋白水平的表达下调[8]。此外，在急性脑缺血/再灌注损伤的过程中，RIC可以抑制多种外周免疫细胞，例如T淋巴细胞、单核细胞等向中枢神经系统的浸润[13]。亦有研究表明，在急性脑缺血/再灌注模型中，RIC可以降低缺血脑皮质中的髓过氧化物酶(MPO)活性，而增加缺血腓肠肌中的MPO活性，提示RIC可能将中性粒细胞“吸引”在实施远隔后处理的肢体肌肉组织内，从而减轻中性粒细胞向脑组织的浸润，并通过MyD88/TRAF6/p38-MAPK途径下调外周血的中性粒细胞中NADPH氧化酶的活化，抑制外周血和大鼠脑组织的中性粒细胞的激活[11]。RIC抑制外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润在急性脑缺血模型中已经被证实[13，14]，能否在慢性脑灌注不足过程中发挥类似的作用目前还不清楚。

4 RIC可减轻中枢神经系统谷氨酸的兴奋毒性

谷氨酸是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，其细胞外含量在正常生理状况下处于低水平。在病理情况下，胞外谷氨酸可以过量积聚，通过发挥兴奋毒性介导神经细胞的死亡。

缺氧可以导致神经元去极化，导致大量谷氨酸释放到突触间隙[15]，引发兴奋毒性；慢性缺血导致的能量供应障碍也可能会导致少突胶质细胞和轴突通过EAATs (excitatory amino acid transporter，兴奋性氨基酸转运体)的逆向转运释放谷氨酸[16]。过量的谷氨酸既可以损伤神经元，也可以作用于少突胶质细胞上的NMDAR、AMPAR等谷氨酸受体，介导对少突胶质细胞的损伤，引起白质疏松等病理改变[17]。Vicente等通过双侧颈总动脉结扎法建立大鼠慢性脑灌注不足模型，10 w后进行大鼠的认知功能评估并取脑组织制作海马切片。结果显示，慢性脑灌注不足可以引起明显的认知功能障碍，且海马切片对谷氨酸的摄取能力显著降低，二者之间呈正相关[18]，显示认知能力的受损与胞外谷氨酸过度积聚引起的神经毒性有关。已有研究报道，在急性脑缺血模型中，RIC可以上调谷氨酰胺合成酶的表达，促进谷氨酸的利用，减少胞外谷氨酸的积聚[19]。谷氨酸兴奋毒性是存在于急性以及慢性脑缺血过程中的共同的病理生理过程，RIC或许能够在慢性脑灌注不足中发挥相似的机制。

5 RIC可诱导外泌体的产生

细胞通过分泌外泌体，将信号分子(包括miRNA，多种细胞通路相关蛋白等)分泌到较远的组织或细胞中，以起到调控作用。外泌体作为人体内一类重要的运输囊泡，参与调节多个细胞传导通路，发挥重要的生理作用，开始受到越来越多的关注。多种细胞(包括内皮细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞等)来源的外泌体均对缺血性脑损伤具有保护作用，它们可以穿过血脑屏障，将其中携带的信号分子运输至中枢神经系统[20]，通过多种机制，例如抑制神经元凋亡、减轻谷氨酸兴奋毒性等对脑组织进行保护。例如，Kalani等发现，外泌体可以减轻脑缺血/再灌注小鼠的梗死体积和水肿程度，降低中枢神经谷氨酸受体NMDAR的表达[21]；Wei等指出外泌体可以通过PI3K/Akt通路减轻谷氨酸的神经毒性[22]；脂肪组织来源的间充质干细胞分泌的外泌体中含有色素上皮衍生因子(PDEF)，对急性缺血/再灌注的脑组织具有保护作用，可能与其激活自噬和抑制神经元凋亡有关[23]。此外，外泌体发挥神经保护作用的机制还涉及其他方面，例如抑制髓鞘的减少等[24]。

RIC能否通过外泌体对缺血脑组织产生影响，近些年来也有学者进行了相关研究。Xiao等研究了RIC对急性脑缺血的保护作用[25]。他们通过动物实验发现在肢体进行RIC可以增加血浆中外泌体的含量，且它们的形态与内皮细胞产生的外泌体相似。进一步通过对SH-SY5Y神经细胞系进行氧糖剥夺/复糖复氧模型，发现内皮细胞产生的外泌体可以在转录和翻译水平促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，减轻神经细胞的凋亡。因而，RIC可能通过诱导肢体血管的内皮细胞产生外泌体从而抑制大脑中神经元的凋亡，可能是其发挥神经保护作用的机制[25]。细胞凋亡是存在于急性和慢性脑缺血过程中的共同的病理生理过程，因而RIC或许也能通过相似的机制减轻慢性脑灌注不足引发的神经细胞凋亡，但仍需要相关研究的证明。另外，外泌体的来源多种多样，包括内皮细胞、脂肪来源的间充质干细胞等。脂肪组织来源的间充质干细胞对脑缺血发挥的保护作用已经被研究证实[23]，且肢体的皮下脂肪丰富，RIC引起肢体的缺血介导脂肪组织的缺血缺氧，可能引发一系列生理变化，但能否介导脂肪组织来源的间充质干细胞分泌外泌体，尚未见相关研究。

6 RIC可能诱导保护性气体类信使分子的产生

近些年越来越多的研究开始关注外周血中的多种气体类信使分子，例如CO、NO等。它们可以由血管内皮细胞产生，随血液循环进入中枢神经系统并发挥作用。内皮细胞产生的NO可以扩张脑血管、增加脑血流[26]，CO则能够抗氧化、阻止血脑屏障破坏[27]、促进神经发生、抗细胞凋亡以及抗炎[28]等。

缺氧可以诱导内皮细胞产生NO以及CO[29，30]。RIC通过对外周肢体使用袖带加压阻断肢体血流后再复流，导致肢体相应部位的血管内皮细胞缺氧，可能诱导NO及CO的生成，但其能否减轻慢性脑灌注不足引起的神经损伤，目前并未有直接的研究证实。

7 RIC可能减少神经细胞凋亡

慢性脑灌注不足可以导致神经细胞的凋亡，是引起认知功能障碍的重要原因之一。

Bax是重要的促凋亡基因，与之相反，Bcl-2则发挥抑制细胞凋亡的作用，二者在与凋亡相关的研究中被广泛关注，特别是Bcl-2/Bax比率，常被用于评估细胞的凋亡状态。Stanojlovic等在研究中通过双侧颈总动脉结扎法建立大鼠慢性脑灌注不足模型，在mRNA水平发现：与对照组相比，慢性脑灌注不足大鼠海马中的Bcl-2水平显著降低，Bax水平显著升高，Bcl-2/Bax比率降低。同时，通过分离海马组织的各种亚细胞结构，进行Western blot检测Bcl-2，Bax等凋亡相关蛋白。与对照组相比，慢性脑灌注不足大鼠海马的神经元线粒体以及突触中的Bcl-2和Bax，在蛋白水平同样存在上述趋势，与mRNA 水平一致[31]。已有研究表明RIC可以抑制神经元的凋亡，并能够在蛋白水平显著提升Bcl-2，并降低Bax水平，进而提高Bcl-2/Bax比率，但此研究结果涉及的领域仍局限于急性脑缺血/再灌注[32]。

RIC引起上述结果的机制可能涉及多种通路，例如JAK2/STAT3通路的激活[32]。然而，关于STAT3对于细胞的作用仍有争议，尽管已有研究认为STAT3的激活可以促进细胞存活，但也有部分研究人员认为它与细胞死亡相关。因而，RIC引发的Bcl-2/Bax比率提高是否确实与JAK2/STAT3通路的激活有关，还需应用JAK2/STAT3通路的特异性抑制剂进行进一步检验。此外，PI3K/Akt也是被研究较多的通路。已有研究表明，慢性脑灌注不足可以引起海马神经元胞质和突触中p-Akt水平的下降[31]，提示Akt的磷酸化过程被抑制可能是慢性脑灌注不足引起Bcl-2/Bax比率下降以及细胞凋亡的原因。而RIC可以激活PI3K/Akt通路。Yu等发现，RIC通过激活PI3K/Akt信号通路提高Bcl-2/Bax比率，诱发心脏保护效应[33]。RIC对PI3K/Akt通路的激活作用也已经在急性脑缺血/再灌注模型中被证实[34]。细胞凋亡是存在于急性和慢性脑缺血过程中的共同的病理生理过程，因而RIC或许可以通过相似的机制减轻慢性脑灌注不足引发的神经细胞凋亡。

8 RIC可能通过调节自噬发挥神经保护作用

关于自噬，其在中枢神经系统不同的病理生理过程中发挥的作用是一把双刃剑，根据损伤类型以及自噬的程度不同，自噬发挥的作用也不同。适度自噬可以清除细胞内衰老的细胞器以及错误折叠蛋白，但过度自噬可能会促进细胞死亡。关于自噬在慢性脑灌注不足发展过程中的作用，目前的大多数研究认为，长期的慢性脑灌注不足会引起自噬的过度激活以及自噬过程异常，加剧神经元死亡及认知功能减退。

Yang等认为，脑灌注不足可以引起小胶质细胞的激活和自噬过程，加剧白质病变和白质缺陷；而自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤)可以抑制其自噬激活，减轻白质损伤并改善记忆[35]。Chen等认为，自噬加剧了双侧颈动脉狭窄的大鼠的神经元损伤[36]。此外，Zou等发现，在慢性脑灌注不足发生后，自噬过程被激活，大鼠皮层和海马中的自噬相关蛋白(Beclin-1，LC3B-Ⅱ，P62)增加。Beclin-1是自噬体形成的关键组成部分，LC3B-Ⅱ有助于自噬体的延伸与成熟，二者的增加表明自噬过程被激活、自噬体的形成增加；P62可以整合到被降解的自噬体中，所以其升高表明自噬体的降解过程受损。因而慢性脑灌注不足会引起自噬启动的过度激活导致自噬体增加，但由于溶酶体成熟的缺陷等原因，自噬的降解过程受损。这种不完整不成熟的异常自噬过程，导致损伤的细胞器和异常蛋白质(如Aβ)不能成功清除，引起认知减退等不良神经功能结果[37]。与此结论一致，Che等的研究同样表明慢性脑灌注不足会引发自噬的激活以及自噬体的增加，但自噬体的降解过程受抑制[38]。

而RIC可以通过多种通路调节中枢神经系统的自噬过程，但不同的研究显示出不同甚至相反的结论。在急性脑缺血/再灌注过程中，RIC可以通过mTOR/p70S6K通路抑制中枢神经系统的自噬，发挥神经保护作用[39]；而另有研究表明，在蛛网膜下腔出血模型中，RIC可以促进自噬，上调大脑皮层中的Beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白，促进自噬溶酶体的增加，保护神经元，改善短期及长期结局[40]。尚未发现有关于RIC在慢性脑灌注不足过程中如何调节自噬的相关报道，或许可以作为进一步研究的方向。

9 临床应用

我们通过文献的整理与分析得出，RIC可能通过：减少中枢神经系统β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集、抑制中枢神经系统的炎症反应、减轻谷氨酸兴奋毒性、诱导神经保护因子例如NO、CO和外泌体的产生、减轻神经细胞凋亡以及调节自噬过程等，在慢性脑灌注不足过程中发挥神经保护作用，然而这些潜在的机制仍需进一步证实。鉴于对临床患者施行RIC具有安全性及易操作性，其广泛应用于临床多种疾病的前景是非常诱人的，例如多种脏器的急性缺血、蛛网膜下腔出血等，也包括慢性脑灌注不足。已有研究显示RIC对于慢性脑灌注不足也具有神经保护作用，其内在的机制以及从基础研究向临床实际应用的转化是一个有趣但相对空白的研究领域。