单碱基编辑工具及在基因治疗中的应用及前景

陶永 赵幸乐 康文 吴皓

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科上海交通大学医学院耳科学研究所上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复）是由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas蛋白构成，可以实现在基因组几乎所有位置的双链DNA断裂修复（DSB）。在CRISPR系统中，核酸内切酶蛋白(Cas)和guide RNA分子形成复合物，复合物可以根据标准的Watson-Crick碱基配对来定位和切割一段目标核酸序列（前间隔序列）。前间隔序列附近必须有Cas蛋白依赖的短核酸序列——PAM[1]。目标核酸序列切割后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）可恢复DNA的完整性。CRISPR系统的出现及其在真核生物基因组编辑领域的应用[2]引发了生命科学的巨大进步，但研究大多基于非同源末端连接修复技术[3]。尽管在细胞系中，通过抑制NHEJ、优化DNA模板等方法，利用HDR的基因编辑技术取得了巨大的进步，但是利用HDR精确修复真核生物基因组的效率仍然非常低。

为了提高基因编辑效率实现在体基因编辑，通过整合化学生物学和基因编辑的方法，实现了DNA上一种碱基直接通过化学转化为另一种碱基，且不会诱导DSB的形成[4]，这种不依赖于同源重组修复的基因编辑方法称为单碱基编辑(Base editing)。单碱基编辑依靠胞苷脱氨酶进行诱导突变，无需切割双链DNA和提供供体模板，可减少DNA损伤并简化编辑过程。单碱基编辑工具可以高效的进行碱基修改，在多个领域取得了广泛应用。

1 单碱基编辑原理

单碱基基因编辑法可以精确地、不可逆地实现从一种碱基对到另一种碱基对的转变，而无需DSB或HDR。最初的碱基编辑器是用一个单链DNA特异性胞苷脱氨酶结合一个失活的Cas9(dCas9)，在靶区域使胞嘧啶(C)·鸟嘌呤(G)碱基对转变为胸腺嘧啶(T)·腺嘌呤(A)。脱氨酶-Cas9复合体利用Cas9:guide RNA:DNA三元复合体的R环中的一小段单链DNA，在靶序列的很小的窗口（约3至5个核苷酸）内催化胞嘧啶脱氨转化为尿苷。

为了促进真核生物中U·G转化为T·A，研究人员发现将83个氨基酸的尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）结合到脱氨酶-Cas9复合体上，可以抑制尿嘧啶转化为胞嘧啶。通过融合褐家鼠APOBEC1胞苷脱氨酶、化脓性链球菌Cas9n(D10A)和枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2 UGI，生成了碱基编辑器——BE3。BE3可形成C·G到T·A的永久性转变，有比HDR更高的编辑效率（15-75%vs＜5%），插入突变率（低于5%）比Cas9基因编辑方法更低。除此之外，多项研究表明BE3比Cas9拥有更低的脱靶率[5]。

为了进一步降低非特异性的突变，将BE3和高保真的SpCas9(HF-Cas9)相结合[6]，降低了BE3和非目标位点的亲和力，从而创造出了拥有更低脱靶率的HF-BE3[7]。然而，它同时也降低了目标位点的编辑率。

为了实现单碱基编辑的可调控性，研究人员设计了一种可以调控的碱基编辑器，将催化自我切割的RNA酶加入guide RNA，只有当配体和它结合的时候，guide RNA才发挥作用[8]。虽然该体系在没有配体的情况下，仍表现出一定的活性，但是其效率比标准的guide RNA低很多，这就使得碱基编辑受控于配体。其它活性诱导的方法，如借助光遗传学[9-10]，将光敏感小分子[11-13]结合到碱基编辑器上，使得基因编辑可以得到调控。

除了BE3，还有多种方法来解决DSBs的固有局限。Target-AID是一种类似BE3的碱基编辑器，它使用了可选择的结构域和脱氨酶，从而使C·G到T·A的转变过程中有一个可变的脱氨基作用区域[14]。另外，通过改变PAM序列获得了碱基编辑能力更强的BE3变异体，将可编辑的潜在基因库增加了2.5倍，拥有更高的灵敏度[15]和更低的脱靶率[7]。

基于之前的研究推出的第四代的碱基编辑器BE4具有尿嘧啶糖基化酶抑制作用，可使目标G·C转化为T·A外其它碱基对的概率减半[16]。

ClinVar数据库中存在3000种基因变异可以通过C-T的碱基替换来修复。然而，鉴于PAM序列的要求（NGG），估计只有300到900个可以编辑[4]。为了解决这些限制，研究人员将BE系统和进化的Cas9系统结合，这些Cas9变异体拥有多种PAM序列，使得BE可以修改2200个C:T或G:A的点突变[15,16]。

临床致病突变多为C·G到T·A，所以需要开发新的碱基编辑工具。最近报道的腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)可以促进A·T向G·C转化，可以高效地使人来源细胞A·T向G·C转化，基因编辑的效率可达50%，DSB的检出率低于0.1%。相比于Cas9核酸酶介导的基因编辑，ABEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。

2 单碱基编辑工具的应用

由于单碱基编辑极大避免了随机插入，基因敲除的结果更有预测性，同时也避免潜在的细胞毒性或混杂的DSB中间体及其副产物的形成。尽管单碱基编辑问世时间不长，却已经展示了巨大的应用价值。

单碱基编辑工具在体应用最早在植物育种中开始。BE3最早用来编辑大米中的OsNRT1.1B、Os-SLR1、OsPDS和OsSBEII基因，C·G到T·A的编辑效率达到12-20%[17]。其它的研究如用BE3编辑大米、小麦、玉米的众多基因，C·G到T·A的编辑效率可高达44%[18]。另外，Target-AID也被用来开发除草剂抗性水稻，C·G到T·A的点突变效率高达32%；通过改变西红柿中涉及植物激素信号转导的基因，多达21%的后代中含有纯合子、杂合子或双等位基因的碱基替换[19]。

单碱基编辑工具能把胞嘧啶精确地转化为胸腺嘧啶，使其作为一种潜在的治疗方法，可针对性地插入突变，已广泛应用于各种动物模型，包括：

（1）通过质粒转染的方法把BE3导入到小鼠星形胶质细胞中,纠正了阿尔茨海默症相关的APOE4基因突变。同样的方法修复了小鼠乳腺癌细胞中TP53突变,效率分别达58%-75%和3%-8%,远远高于CRISPR/Cas9，而且插入缺失率也更低[4]。

（2）将携带有BE3:sgRNA复合体的RNP脂质纳米粒注射入斑马鱼胚胎中,成功修改了TYR1,TYR2,TYR3基因，效率为5%，脱靶率＜2%[7]。

（3）在Ldlr敲除导致的高血脂小鼠予以BE3-Angptl3治疗，可以减少血液中甘油三脂（下降56%）和胆固醇（下降51%），从而为单碱基编辑工具治疗脂质代谢异常提供依据[20]。

（4）通过腺病毒载体转导，在小鼠肝脏中成功对PCSK9进行了碱基编辑，编辑的效率为19%至34%，使血浆胆固醇水平下降了约30%[21]。

（5）通过RNP电穿孔和mRNA显微注射把BE3注入到小鼠胚胎，来纠正Dmd,Tyr基因，治疗了假性肥大性肌影响不良和白化病，突变频率16%-100%[22]。

单碱基编辑工具已经在内耳得到应用：向耳蜗内导入脂质体包裹的BE3蛋白:guide RNA可以在内耳组织实现碱基的置换：将BE3蛋白（原液浓度57.7mM）与guide RNA（原液浓度100mM）以1：1.1摩尔比预先混合，然后以1：1体积比与Lipofectamine 2000混合。将1.2-1.5ml混合液注入耳蜗的底圈中阶，速率为250 nl/min。3-4天后提取DNA后进行高通量测序。实验证实将脂质体混合BE3-guide RNA后注射至新生小鼠内耳，可以修改内耳细胞的VEGFA基因，效率为＜1.5%，插入缺失率为＜0.1%[7]。相较于体外编辑效率，体内的碱基转化效率偏低，但内耳的局部注射可以靶向多种细胞，为内耳基因治疗的提供了新的工具。

BE3还可用来实现CRISPR-STOP和iSTOP，通过引入终止密码子实现基因的敲除[23]。

ABEs可将A·T转化为G·C，单碱基编辑工具治疗致病突变的适应症大大增加。β-球蛋白基因突变可引起多种血液疾病，但是γ-球蛋白基因HBG1和HBG2的启动子突变导致携带HPFH的人群能够抵抗一些β-球蛋白性疾病。利用ABEs同时把HBG1和HBG2启动子的198位的T转换成C，可以使胎儿血红蛋白在成年人中持续表达。铁贮积症遗传性血色病（HHC）是一种常染色体隐性遗传性疾病，通常是由HFE基因第845位的G突变引起HFE蛋白中C282Y的转变（282位半胱氨酸转变为酪氨酸）,导致铁吸收过多，危及生命的血清铁蛋白升高[24]。用ABE7.10和guide RNA共同转染可以将目标腺嘌呤导入到含有HFE C282Y突变的不可再生的成淋巴细胞系(LCL)。结果观察到282位的酪氨酸有28%的转化为半胱氨酸，且在靶位点没有发现任何不想要的编辑或插入突变。目前的ABEs编辑方法仍需进一步改造以用于潜在的临床基因治疗，如发展ABEs使其有更广泛的PAM。这些例子表明，ABEs可在人类细胞中修复疾病的基因突变，也可以诱导产生基因突变来抑制某些遗传病的表型。

CRISPR-X和Target-AID诱导突变(TAM)[25]利用dCas9-胞苷脱氨酶融合技术，可导致guide RNA靶定基因组区域的饱和诱变。当缺乏碱基切除修复抑制剂如UGI时，UGI中间体通过碱基切除修复酶尿嘧啶DNA糖基化酶变成一个空白碱基位点，接着通过DNA修复过程形成G·C和A·T碱基对，而不是T·A产物。CRISPR-X和TAM利用此修复结果来随机突变C·G碱基对，由此产生遗传编码的突变库。

3 单碱基编辑工具的前景

对和dCas9相结合的酶进行进一步改造可能会扩大碱基编辑技术的应用范围。特别是改造脱氨酶或DNA修复机制可以使不同的碱基转换成为可能。脱氨酶是由各种酶组成的一个庞大的家族。腺苷脱氨酶的使用将会扩大目标碱基的范围从而实现腺嘌呤向其它碱基的转换。

碱基编辑可以有效地诱导突变，而后生成基因变异库以筛选出特定的表型；结合这两种应用，我们可以产生大量的表型和致病性的单核苷酸多态性。大多数已知的疾病相关的基因变异都是点突变[26]，碱基编辑器可以修复点突变，同时也可以作用于野生型而产生突变。最近，也有人用活性Cas9通过饱和突变的方法来确认影响MYB表达的随机突变[27]。除了产生基因突变之外，广泛的、多样化的碱基编辑器还可以识别并影响表型已知的和新的基因突变。这些方法可以确定基因突变与表型的关系，可增加对疾病发病机制中起关键作用的氨基酸的认识。

虽然对Cas9中靶和脱靶效应的量化已经做了很多工作[28-30]，但是对碱基编辑却仍然没有出现类似的量化方法。细胞[31]和组织[32]中无偏差的、敏感的、全基因组的脱靶检测方法依赖于双链DNA的断裂，并不适合于单碱基编辑。虽然碱基编辑器脱靶可以用体外实验来检测[5]，例如全基因组测序和有针对性的测序，但尚未开发出用于检测细胞和组织中的脱靶效率。这些新方法将对促进单碱基编辑的脱靶检测具有关键作用。

随着基因编辑技术的发展和成熟，利用CRISPR/Cas9编辑技术实现耳聋基因动物模型的建立已成为现实[33]，基因编辑技术在遗传性耳聋的治疗中也将发挥更大的作用[34]。单碱基编辑工具是新一代高效基因编辑工具，可将一个目标碱基对在不需要DSB的情况下转变为不同的碱基对，是遗传性疾病的研究和治疗的有效技术。最近的研究表明单碱基编辑工具可应用于内耳研究，是内耳基因治疗的潜在工具。

CRISPR功能强大，但HDR效率尚不足以在体进行基因修改。单碱基编辑工具可以实现在体基因修改，是基因治疗的良好工具。目前单碱基编辑工具只能实现G·C转化为T·A或是A·T转化为G·C，适应症较少。随着单碱基编辑工具的研发，未来可能通过碱基的任意转化实现基因治疗。

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