PKCε-Nampt通路调控线粒体自噬防治脑缺血损伤的研究进展

， ，，， ，

细胞经自噬途径选择性降解损伤或多余的线粒体的过程即为线粒体自噬。线粒体自噬对于线粒体的质量控制至关重要，并且参与多种中枢神经系统疾病的病理过程，其中包括缺血性脑损伤，即脑缺血。越来越多的证据表明线粒体自噬在不同的脑缺血病理过程中扮演了重要的角色。近年来，线粒体自噬被认为具有神经保护作用，且调控线粒体自噬对细胞存活非常重要。因此，国内外越来越多的研究关注线粒体自噬的过程和其具体调控机制。本研究旨在对蛋白激酶Cε(PKCε)-烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)通路的作用机制进行阐述，并总结其调控线粒体自噬的可能机制和在脑缺血中扮演的角色，为脑缺血的线粒体靶向治疗提供新思路。

1 蛋白激酶C(PKC)和PKCε-Nampt通路

PKC是一种参与信号传导通路非常重要的蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，PKC通过使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化而发挥生物学功能[1-2]。细胞内大部分生命过程，如物质转运、代谢、生长、发育、凋亡、各种应激事件及神经活动的发生都涉及蛋白激酶磷酸化，并且蛋白激酶磷酸化也是多种信号转导途径中及其重要的环节。PKC不仅能使底物蛋白分子内的丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化，而且还能够影响基因的表达调节和细胞增生等，其在机体作用很广泛[2]。经典型的PKC(cPKC)包括α、βⅠ、βⅡ、γ四种亚型；新奇型的PKC(nPKC)包括δ、θ、η、ε四种亚型；非经典型的PKC(aPKC)包括λ、ξ。其中PKCε在脑组织内含量十分丰富。PKC可影响神经细胞的生存，影响神经功能恢复，与神经细胞的凋亡及坏死密切相关。因此PKC与中枢神经系统疾病的发病机制密切相关。

目前国外对于PKCε-Nampt通路通过调控线粒体自噬从而保护缺血缺氧的神经元的研究正处于上升期[3]。其保护神经元的具体机制及其在预防和治疗脑缺血疾病方面的潜在临床价值仍有待研究[4]。PKCε是PKC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶同种型，能够赋予大规模线粒体保护，从而诱导神经保护，同时是其他致命性缺血性损伤的重要信号通路。Nampt是参与氧化型辅酶Ⅰ(NAD)生产的酶，能够维持线粒体功能和赋予缺血性应激后的神经保护。脑缺血后的异常能量代谢诱导线粒体损伤，例如减少呼吸、自由基产生和促凋亡因子的释放[1，5]。保持线粒体健康的机制，增强缺血性损伤后的神经元活力，是产生缺血耐受的关键[6]。

2 PKCε与AMP激活蛋白激酶(AMPK)的调控关系

PKCε活性影响许多与缺血性神经保护相关的线粒体过程的下游信号传导途径。研究发现，皮质PKCε可以调节丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节激酶(MAPK)途径和AMPK，表明PKCε能够，调节线粒体生理学的酶调节转录因子和基因表达[7-9]，PKCε还可以直接调节线粒体功能。在海马的研究表明PKC可易位到线粒体，从而磷酸化线粒体K+-ATP通道[10-11]，增加线粒体呼吸，减少线粒体氧化应激活性氧(ROS)产生，并抑制细胞色素C释放[12-13]共同发挥作用保护线粒体对缺血的损伤。

Morris-Blanco等[5]在体外实验中将神经元胶质皮层培养物暴露在ΨεRACK(Tat-结合的PKCε活化剂)(100 nmol/L)1 h后，分析神经元胶质皮层培养物中的全细胞裂解物，其显示磷酸化AMPKThr172(AMPK的活化形式)水平显著增加，同时还评估了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化(是AMPK的直接下游靶标)。ACCSer79磷酸化在ψεRACK处理后也显著增加。同时为了确定PKCε是否在体内激活AMPK，Morris-Blanco 等[5]在将大鼠经ψεRACK腹膜内注射(0.5 mg / kg)后1 h从皮质中收集全细胞裂解物，这也导致磷酸化-AMPKThr172和磷酸-ACCSer79的显著增加，表明PKCε足以激活AMPK，PKCε是缺血或白藜芦醇预处理期间AMPK激活所需的关键信号通路。这些研究充分证明AMPK是PKCε调控的下游。

3 PKCε与AMPK共同参与调控Nampt，以PKCε为主

Neumann 等[14]研究发现缺血预处理在48 h后诱导Nampt水平增加(1.7±0.2)倍，但通过添加PKCε抑制剂ζV1-2可阻断该效应。同时在IPC期间暴露于AMPK抑制剂对线粒体Nampt水平没有影响。表明PKCε是缺血预处理后增加线粒体Nampt必不可少的因素。AMPK通过其与p53的相互作用促进凋亡性细胞死亡；AMPK还通过调节各种转录因子和配体调节剂[PGC1alpha、FOXO3a和sirtuin 1(SIRT1)]诱导线粒体产生，增强线粒体活性氧清除剂的表达，并增加线粒体呼吸，从而保护神经元细胞[15]。AMPK可以增强Nampt的表达，Nampt是NAD主要生物合成途径中的限速酶。尽管AMPK参与增强Nampt mRNA表达[16-17]，但目前还没有研究调查了AMPK调节Nampt的线粒体特异性库。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是三羧酸循环和电子传递链在维持线粒体膜电位和产生三磷酸腺苷(ATP)中所必需辅酶[1，18]。在脑中，氧化应激或缺血事件后NAD的减少引起线粒体去极化，减少呼吸，产生凋亡信号和神经元死亡。相反，研究证实细胞NAD的增加能预防脑缺血后线粒体功能障碍和神经变性[5，10]。缺血事件期间NAD的减少引起DNA损伤，能量耗竭并导致神经变性。Nampt过表达产生NAD来预防局部缺血后的线粒体功能障碍和神经元死亡[10，19]。在氧化应激后特异性增强线粒体定位的NAD能够保持线粒体膜电位，增强呼吸并防止凋亡诱导因子在大脑中的释放。Nampt对神经退行性损伤的保护作用最近已成为激烈研究的焦点。PKCε调节线粒体Nampt增加与NAD + / NADH比率的增加相关。NAD + / NADH比率的增加与NAD+依赖SIRT的活性相关。PKCε也可通过增加线粒体中的NAD + / NADH比率来调节线粒体SIRT活性。在缺血期间，PARP(DNA修复酶)的过度激活介导NAD +消耗和凋亡信号传导。PKCε介导的线粒体NAD+可用性的增加可能有助于稳定线粒体PARP的活性，维持NAD+库，从而维持线粒体DNA完整性和预防细胞死亡[6，20]。在缺血或氧化应激期间通过线粒体NAD的保存可以维持电子传输链的活性，增强SIRT活性和防止PARP介导的NAD+耗尽来增强神经元活力。

4 PKCε-Nampt通路通过调控线粒体脱硫酶基因提供缺血性神经保护

PKC家族已经连接到sirtuins[21-22]，是NAD +依赖性赖氨酸脱酰酶，与缺血和线粒体神经保护相关。sirtuins的主要调节剂是Nampt，其通过增加NAD +水平增强sirtuin活性[23-24]。Nampt在预防脑缺血后的神经变性中至关重要，因为遗传研究显示当Nampt被敲除时损伤加重[25-26]。Nampt过表达激活SIRT减弱缺血性损伤，表明Nampt-沉默调节蛋白通路可能对缺血性保护具有重要作用。哺乳动物沉默调节蛋白家族由七种同工型(SIRT1-7)组成，它们的蛋白质靶点，亚细胞定位和酶活性不同。虽然研究证实核或细胞质sirtuins与脑中的缺血保护相关[27-29]，sirtuins在IPC保护免受缺血性应激的能力中起着不可或缺的作用，但是研究重点一直在于SIRT1的核或细胞质活性。SIRT3-5是公认的线粒体沉默调节蛋白，其各自显示独特的酶翻译后修饰[30]。例如，SIRT3是赖氨酸脱乙酰酶，SIRT4是赖氨酸ADP-核糖基酶，SIRT5是赖氨酸脱琥珀酰酶[2，19，31]。SIRT3和SIRT5定位于线粒体，分别被鉴定为线粒体赖氨酸脱乙酰化和赖氨酸脱琥珀酰化的主要调节剂[24，31]。蛋白质组学分析表明，约三分之一的线粒体蛋白含有赖氨酸乙酰基或赖氨酸琥珀酰基位点[24，31]，这表明SIRT3和SIRT5可能对线粒体功能具有广泛的影响。

Nampt是sirtuin活性的有效活化剂，因为sirtuin需要NAD +作为辅因子以驱动其活性。Morris-Blanco等[5]研究表明脑缺血后48 h，SIRT5脱琥珀酰酶活性在大鼠神经元-星形胶质细胞培养物的线粒体中增加。通过在脑缺血期间暴露大鼠神经元-星形胶质细胞于PKCε抑制剂εV1-2至线粒体，SIRT5活性的这种增加被消除。与SIRT5活性结果相反，ΨεRACK处理对线粒体SIRT3脱乙酰酶活性没有影响。在ΨεRACK处理后48 h没有观察到线粒体蛋白或SIRT3的赖氨酸乙酰化状态的总体变化。这些数据表明PKCε和线粒体Nampt是SIRT5去琥珀酰酶活性的主要调节剂；PKCε-Nampt通路增强神经保护和皮质线粒体SIRT5表达；SIRT5参与调节线粒体生物能量代谢、呼吸和脑缺血的神经保护。

SIRT5阻止细胞死亡的确切机制目前还不清楚，但可能包括多种机制。例如，在脑缺血后，BAX转移到线粒体，其中它结合到ATP/ADP转位酶以形成涉及触发细胞色素C的释放和caspase介导的凋亡信号级联的线粒体通透性转换孔[21]。 PKCε通过防止凋亡信号传导[9]为缺血后的心肌细胞提供保护。SIRT5与心肌细胞培养中的Bcl-xL(一种结合BAX的蛋白)的水平相互作用并调节其水平。此外，在氧化应激后，SIRT5的敲低增加胱天蛋白酶活性。SIRT5也可以与细胞色素C[32-33]相互作用，但是这种相互作用的功能结果目前还不清楚。该证据表明，在PKCε活化后，SIRT5介导的针对细胞死亡的保护可以包括参与细胞凋亡的几种蛋白质和酶。

5 PKCε-AMPK-Nampt-SIRT5协同调节神经元中的线粒体功能

PKCε在对脑缺血的保护中具有确定的作用。在缺血损伤之前，期间或之后使用PKCε的药理学活化剂能有效防止皮质和海马中的神经变性[32]。 PKCε已被证明可对由脑缺血引发的缺血缺氧[9，33]提供强大的神经保护；同时PKCε对于由白藜芦醇和转录激活剂AMPK提供的缺血性神经保护也可能是必需的。研究发现PKCε在脑缺血期间能够预防兴奋性毒性信号传导和减少微血管血流量[34]。 PKCε进一步通过调节转录因子和基因表达以及直接磷酸化线粒体蛋白质来提供线粒体保护，以增加ATP产生，降低活性氧簇产生，维持线粒体膜电位和减少线粒体肿胀[8-9，35]。PKCε激活AMPK，增加Nampt线粒体池，从而增强NAD +水平，提供线粒体保护，减轻脑组织缺血损伤。Nampt是PKCε介导的缺血保护和调节SIRT5活性所必需的。这种保护途径最可能发生在神经元中，因为Nampt主要在神经元中表达[25-26]，SIRT5在神经元中相对于神经胶质细胞更强烈地表达[29，36]。

目前的研究表明，PKCε-Nampt通路选择性增强SIRT5活性，而SIRT3活性保持不变。因此，PKCε可能提高SIRT5蛋白的稳定性。然而使用Nampt抑制剂在分离的线粒体上的实验揭示，SIRT5去琥珀酰酶活性的增加与增加的NAD+可用性直接相关。基于这一证据，Nampt和NAD +的产生似乎是SIRT5活性增加的驱动因素。SIRT5和Nampt水平在PKCε激活后的线粒体中增加的事实表明，这些酶可以充分协同调节对线粒体功能的影响。

6 总结与展望

PKCε在缺血诱导后被激活，能够增强转录激活因子AMPK的活性，进而上调Nampt的表达，导致线粒体Nampt增加，Nampt水平上调增强NAD +水平，进而诱导并增加SIRT5的赖氨酸脱琥珀酰酶活性。SIRT5去琥珀酸化线粒体中的多个未知靶点，导致线粒体复合体活性的维持和对缺血损伤的保护。

尽管PKCε已经在脑缺血中广泛研究，但是在实验性卒中模型中PKCε的作用机制研究缺乏。Bright等[37]研究显示线粒体选择性PKCε激活剂在缺血再灌注损伤后24 h改善神经学评分，这表明线粒体PKCε激活可为脑缺血提供更好的治疗作用。脑缺血后的许多异常细胞聚集在线粒体上，导致能量代谢失败，氧化应激和凋亡信号传导[5]。在已往的研究中，PKCε-Nampt通路已被确定为参与缺血性损伤后稳定线粒体的主要参与者[33，38-39]。作为线粒体琥珀酰化的广泛调节剂，SIRT5可以通过调节许多线粒体蛋白和酶以提供保护[40-41]，继而保持线粒体生物能量运转和保护大脑中的代谢应激和缺血性损伤。目前，抗缺血性脑卒中的中药有效成分，多对线粒体自噬具有一定调控作用。进一步研究SIRT5如何被优先激活及其介导线粒体保护的作用机制以及PKCε-Nampt通路调控线粒体自噬保护缺血神经元的其他可能机制，可以帮助确定中药调控PKCε-Nampt通路、线粒体自噬的靶点，为脑缺血的线粒体靶向治疗提供新思路。