灯盏花乙素防治缺血性心脑血管疾病的分子机制研究进展

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脑梗死和心肌梗死是常见的缺血性心脑血管疾病(ischemic cardiovascular and cerebrovascular disease，ICCVD)，世界十大致死疾病排名，ICCVD居各种疾病死因第一位[1]。临床ICCVD的治疗一般是：急性期溶栓及介入治疗；亚急性期神经保护剂应用；恢复期各类康复治疗。由于ICCVD涉及多通路、多靶点及ICCVD后遗症，极大地限制一般治疗方法的应用。因此从天然产物中寻找具有抗心肌细胞和脑细胞缺血、缺氧的活性物质，是治疗ICCVD的主要方法。

灯盏花乙素(scutellarin，SCU)即4，5，6-三羟基黄酮-7-葡糖醛酸苷，是从中国传统中药灯盏细辛中提取的一种黄酮，占灯盏花素含量90%以上[2]。SCU通过释放神经营养因子、增加蛋白激酶G(PKG)活性、拮抗氧化应激、抑制兴奋性氨基酸产生、抑制炎性介质释放、抑制促凋亡因子、调节Ca2+通道、拮抗细胞凋亡、保护内皮细胞等多靶点防治ICCVD。

1 释放神经营养因子

神经营养因子(secreting neurotrophic factors，NTFs)是一类由神经支配的组织(如肌肉)和星形胶质细胞产生的，神经元生长与存活所必需的蛋白质分子。其中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)对神经元生长、发育和功能完整性有重要作用。NGF能增加脑血流量、减少梗死体积和改善缺氧损伤导致的神经功能障碍[3]。BDNF对神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用[4]。通过抑制小胶质细胞和一氧化氮(NO)的产生，保护多巴胺能神经[5]。

Chai等[6]通过脑中动脉缺血(MCAO)模型发现，给予SCU后，星型胶质细胞mRNA和蛋白质中NGF、BDNF及GDNF因激活p-CREB和p-Akt信号通路，使其表达增加，拮抗缺血性脑损伤。Moosavi等[7]研究表明，释放NGF和BDNF是SCU在体内外发挥神经营养作用的关键。

2 对蛋白激酶的影响

蛋白激酶B(PKB)在细胞存活和凋亡中起重要作用，又称Akt。Chai等[6]表明，因激活星型胶质细胞的PKB信号通路增加其蛋白质中NGF、BDNF及GDNF的表达，发挥神经保护作用。这与Moosavi等[7]研究结果一致。

蛋白激酶C(PKC)有11种亚型，在细胞的生长、分化、细胞代谢及转录激活等方面发挥重要作用。Xu等[8]将未分化的嗜铬细胞瘤PC12细胞进行缺血缺氧处理作为体外缺血缺氧再灌注模型，给予SCU，结果表明SCU抑制PKC活性，减少对PC12细胞的损伤。SCU可抑制糖尿病综合征鼠胸主动脉PKCβ1、PKCβ2、和PKCδ易位，治疗糖尿病[9]。

Chen等[10]通过缺氧-再给氧(HR)诱导冠状动脉内皮损伤表明，SCU激活PKG，作用于其底物血管扩张刺激群蛋白(VASP)，VASP产生磷酸化作用，生成pVASP，保护血管内皮细胞。Li等[11]分别以不同浓度SCU给予(45 mg/kg和90 mg/kg，静脉注射)缺血缺氧再灌注(MIR)损伤鼠和HR诱导损伤的人心脏微血管内皮细胞(HCMECs)(1 μmol/L和10 μmol/L)，其中VASP在Ser239位点的磷酸化作用(pVASP)与VASP比值反映PKG活性。给予SCU 2 h后结果发现，SCU增加PKG活性，且呈剂量依赖性减少梗死面积和恢复离体冠状动脉环的内皮依赖性舒张功能。其机制是SCU激活靶点PKG1-a在Ser50、Ser72、Ser89、Ser44和Thr58位点的磷酸化作用，拮抗MIR损伤和HR诱导内皮损伤导致的细胞凋亡。这与Liu等[12]结果一致。Du等[13]研究SCU对内皮细胞功能的保护作用时也应用体内外模型，体外与Li等[11]采用的模型一致，但体内采用的是脑缺血再灌损伤(CIR)鼠。将人脑微血管内皮细胞(HBMECs)缺氧12 h，再给氧12 h后分为5组：对照组、HR模型组、HR+SCU 0.1 μmol/L组、HR+SCU 1μmol/L组、HR+SCU 10μmol/L组，给予SCU 2 h后发现，SCU呈剂量依赖性地增加pVASP、VASP表达和PKG-Ⅰ的活性。SCU减少脑梗死面积和恢复离体基底动脉环的内皮依赖性舒张功能。拮抗CIR损伤和HR诱导内皮损伤导致的细胞凋亡。Zhang等[14]研究证实SCU拮抗脑血管内皮功能障碍是通过激活PKG信号通路。

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)是一种应激激活蛋白，被一些促炎因子如转化生长因子(TGF)α、白介素-1(IL-1)等应激激活。细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化后抗凋亡，同时激活转录因子，以刺激表达存活相关基因产生抗凋亡作用。结扎大鼠冠状动脉8周造成间质纤维化和心功能不全，腹腔注射SCU后应用PCR和Western blot技术检测，发现TGFβ、p38-MAPK的表达被抑制，ERK1/2表达增加，起到了保护作用[15]。

3 拮抗氧化应激

ICCVD使活性氧(ROS)的产生远强于清除能力，造成ROS过度蓄积及脂质过氧化反应产生代谢物丙二醛(MDA)等均致使大量自由基产生，降低超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)活性，加重心肌梗死、脑梗死再灌损伤。Hu等[16]建立MCAO模型鼠，经SCU预处理7 d，Western blotting检测eNOS表达上调，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)表达下调，大鼠梗死体积明显减少。Liu等[17]通过H2O2诱导模拟神经损伤，表明SCU可减少cNOS表达，从而减少神经损伤。通过喂养高脂饲料诱导形成高脂血症鼠，给予SCU后发现内皮细胞eNOS增加，提高乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张活性，起到抗高脂血症的作用[18]。有研究观察SCU拮抗氧化应激导致的细胞凋亡作用，将PC12细胞暴露于H2O2环境中，激活氧化应激，ROS和MDA过度表达，脂质过氧化，用SCU预处理后可逆转，保护细胞[19]。与Hong等[20]之前用H2O2处理SCU孵育过的PC12细胞结果一致，且SCU较抗氧剂VitE效价高。Guo等[21]研究表明，SCU可增加SOD，降低MDA产生，拮抗氧化应激，减少Aβ蛋白产生导致的神经毒性。Guo等[22]通过MCAO诱导大鼠缺血缺氧后给予SCU，结果说明SCU可拮抗因缺血性脑损伤导致的SOD、CAT和GSH下降，减少ROS产生，降低脑梗死体积，保护内皮细胞，起到神经保护作用。这与Yang等[23]研究结果一致，SCU降低肝组织MDA水平(P<0.05)及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性(P<0.01)，升高SOD(P<0.05)和谷胱甘肽过氧化物(GSH-PX)(P<0.01)水平，拮抗因脑缺血再灌注损伤引起的肝损伤。

4 抑制兴奋性氨基酸产生

兴奋性氨基酸(EAA)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、海仁藻氨酸(KA)、喹啉酸等，是中枢神经系统的主要兴奋性神经介质。在ICCVD等病理生理条件下，EAA受体过度激活，造成神经损伤，产生“兴奋毒性”。SCU可抑制离子型谷氨酸受体表达，阻止神经元凋亡[24]。结扎双侧颈总动脉大鼠给予SCU结果表明，SCU抑制Glu、Asp、氨基丁酸(GABA)表达，拮抗缺血再灌损伤[25]。

5 抑制炎性介质释放

核转录因子κB(NF-κB)为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：Rel(cRel)、p65(RelA，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。不需要翻译新的蛋白进行调控，可与特异性κB序列结合后诱导相关基因转录。Chen等[26]研究发现SCU显著减少NF-κB，阻断炎性应答，抗高血压。Yuan等[27]研究表明，SCU通过抑制MCAO模型鼠和小神经胶质细胞NF-κB，抑制炎症反应，拮抗缺血损伤。Wang等[28]研究SCU的神经保护机制，尤其是小胶质细胞的抗炎作用，显示由于SCU抑制脂多糖诱导产生的炎性介质，如NO、肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1β、ROS，抑制脂多糖诱导产生的核易位和DNA与NF-κB结合的活性。表明SCU可治疗小胶质细胞介导的不同神经炎症。

永久性MCAO实验发现，SCU可抑制缺血脑区炎性介质TNF-α、IL-6和IL-1β及血管紧张素转化酶(ACE)的释放，增加血流量，拮抗缺血导致的炎症反应[29]。Luo等[30]研究SCU对高糖诱导的血管炎性保护作用时，应用人内皮细胞ECV304给予高糖诱导后，给予SCU预处理，结果显示SCU呈浓度依赖性(0.1 mmol/L～1 mmol/L)减少细胞间黏附分子1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)含量，发挥抗血管炎症作用。

6 抑制促凋亡因子

IL-1β、IL-6 、TNF-α、Caspases3等均为促凋亡因子。Guo等[31]将Wistar鼠随机分成对照组、Aβ组(给予Aβ蛋白诱导为HR)、Aβ+SCU组，结果Aβ组IL-1β、IL-6、TNF-α表达增加，Aβ+SCU组下降，表明SCU可抑制促凋亡因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达，从而抑制炎症反应与细胞凋亡，与Wang等[29]研究结果一致。Chen等[26]证实SCU可抑制TNF-α、IL-1β、IL-18、Bax和Caspases3表达，阻断炎性应答反应，抗高血压。将出生3 d的新生鼠建立心肌缺血损伤模型及取其心室组织细胞结果均为SCU抑制细胞色素C(CytC)的释放和Caspases3的活性，拮抗缺血性心肌细胞凋亡。Li等[32]取新生SD鼠心肌细胞原代培养4 d后分为5组：对照组、心肌缺氧组、心肌缺氧给予高、中、低SCU处理组，发现SCU通过下调促凋亡基因Bax，上调抑制凋亡基因Bcl-2表达，保护心肌细胞。

7 调节Ca2+通道

Ca2+通道在神经元的不同部位表达不同。神经元胞膜钙离子通道有电压依赖性通道(Cav)、配体操纵性通道。其中Cav有L、N、P、Q、R、T 6种亚型。配体操纵性通道有两大类：Glu依赖性通道和非Glu依赖性通道。在神经元内钙离子通道也分两大类：IP3R和阿若碱受体(ryanodine)敏感的钙离子通道。ryanodine敏感的钙离子通道其有RYR1、RYR2、RYR3三个亚型，其中脑内主要为RYR3。Liu等[33]研究表明，SCU抑制Ca2+内流，上调钠-钾交换三磷酸腺苷酶的活性，拮抗氧化应激，发挥保护效应。Pan等[34]在研究SCU对心脏肥大的作用及机制时，用激光扫描共聚焦显微技术在体内体外发现，SCU通过抑制细胞外Ca2+内流，阻断Ca2+下游效应器钙神经素和磷酸化钙调蛋白激酶2(CaMKⅡ)通路，拮抗心脏肥大。Pan等[35]研究SCU舒张血管机制时，将大鼠胸主动脉内皮细胞分为完整型与损伤型，给予不同浓度(3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L)SCU，发现SCU呈剂量依赖性抑制神经元胞膜的电压依赖性Ca2+通道，抑制细胞外Ca2+内流，扩张Ca2+诱导收缩的血管，保护内皮细胞。Zhu等[36]研究结果显示，SCU能阻断心肌肌质网钙转运，阻断电压依赖性Ca2+通道开放，保护心肌平滑肌细胞。

8 拮抗细胞凋亡

SCU通过拮抗神经干细胞凋亡，减弱多发性硬化导致的运动缺陷[37]。Zhang等[38]研究大鼠瞬时脑缺血，表明SCU抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)依赖的线粒体功能障碍的过度活化和细胞凋亡诱导因子(AIF)核易位，拮抗神经细胞凋亡。Ghosh等[39]研究表明SCU具有拮抗神经元凋亡、抗氧化等作用。

9 保护内皮细胞

血管内皮细胞(VEC)位于血液与血管组织之间，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，而且合成和分泌多种生物活性物质，保证血管正常的收缩和舒张，维持血管张力，调节血压及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。内皮细胞参与早期的缺血再灌注损伤(IR)损伤，对IR损伤较敏感，易造成内皮细胞损伤与内皮功能障碍。

小鼠胸主动脉环实验结果发现，SCU呈剂量依赖性松弛因去甲肾上腺素刺激引起的胸主动脉收缩作用，松弛作用在去除内皮时下降，此作用被一氧化氮合酶抑制剂和可溶性的鸟苷酸环化酶抑制剂抑制。CAT抑制剂可增加主动脉的收缩，抑制SCU最低浓度引起的松弛作用。300 μmol/L和1 000 μmol/L SCU可明显抑制由去氧肾上腺素引起的剂量依赖性收缩，舒张血管。表明SCU舒张血管作用与内皮细胞NO信号转导有关，且具有内皮细胞依赖性[40]。Shi等[41]将12 h缺氧(5%CO2+2%O2+93% N2)和12 h的再给氧(5%CO2+95%空气)处理的心脏微血管内皮细胞分为4组：对照组、HR组、SCU+HR组、依达拉奉+HR组。SCU+HR组以SCU(1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)剂量处理2 h，结果SCU可上调核翻译起始因子(EIF6)表达，保护心内皮细胞，SCU通过增加伴侣蛋白HSPD和CCT6A表达，拮抗HR导致的心脏微血管内皮损伤。血管生成在生理和病理过程中起着重要作用，参与缺血性心脏病、糖尿病、慢性炎症和癌症等疾病。Gao等[42]将SCU给药至Aβ+人脐静脉内皮细胞上，通过细胞培养发现，SCU呈剂量依赖性增加金属基质蛋白酶(MMP)-2诱导血管生成。SCU给药量为10 μmol/L时，可促进血管增殖、迁移、入侵及形成，发挥SCU促血管生成作用，治疗缺血性心血管疾病。

10 其 他

SCU可上调细胞外信号调节激酶5(p-Erk5)和人样转录因子2(KLF2)，缓解因蛛网膜下隙出血导致的血管痉挛[43]。EIF6[44]分子量约26 kD，一种参与核糖体亚基生物合成和组装，进化保守的单体蛋白质，可抑制Bax，调节细胞生长。SCU可抑制细胞色素P450同工酶1A2(CYP1A2)的代谢[45]。Zhu等[46]研究SCU对绝经后综合征和阿尔兹海默症神经保护作用时发现，SCU可抑制大鼠体内及PC12细胞Aβ蛋白的表达，发挥神经保护作用。

11 小 结

随着生活水平的提高，压力的增大，人们患有高血压、脑血栓等心脑血管疾病的风险也越来越高。天然药物现代化进程的加快，其有效成分及单体防治缺血性心脑血管疾病已成为研究热点。SCU可松弛胸主动脉和腹主动脉，减少血管阻力，降低舒张压[35]，且SCU在20世纪70年代临床用于防治ICCVD，效果优于灯盏花素[26，47]。每日服用 50 mg～200 mg可治疗冠状动脉心脏病，抗心绞痛，拮抗心肌缺血和中风[48-50]。随着研究日趋增多及现代科学技术发展，对SCU分子机制和SCU相关信号通路的揭示，为SCU的运用前景提供基础。