鸡传染性支气管炎病毒实验室检测方法研究进展*

庄金秋 ，阮震 ，张颖 ，梅建国 ，苗立中

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.滨州市滨城区里则街道办事处畜牧兽医工作站，山东 滨州 256656）

鸡传染性支气管炎 （Avian infectious bronchitis，IB）是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒 （Infectious bronchitis virus，IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性、呼吸道传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，引起呼吸道疾病、腹泻以及产蛋鸡产蛋数量和质量下降、肉鸡群的增重和饲料转化率降低，并可致雏鸡死亡。该病首先由Shalk等人于1931年在美国首先报道，我国邝荣禄等人于1972年首次在广东报道[1]。IBV呈世界性流行，是危害养禽业发展的重大传染病之一，给世界养禽业造成了严重的经济损失。IBV不断变异，目前已发现30多种血清型，不同血清型的IBV之间仅有部分或完全没有交叉免疫保护，且伴有混合感染、继发感染等因素，给IB的免疫预防和诊断带来了很大困难。因此，为有效地控制IBV的流行，建立快速准确的检测方法以区别不同IBV血清型致病毒株具有重要意义。本文从该病的病原分离和鉴定、血清学及分子生物学等方面对IB的实验室检测方法最新研究进展进行了综述。

1 病毒分离与鉴定

病毒分离鉴定是检测病原的金标准。IBV一般从病鸡的气管、肺脏、肾脏、扁桃体、泄殖腔等组织采样，在SPF鸡胚、鸡气管组织培养物（TOC）和细胞上进行培养。IBV在这三种培养系统中引起的病变都不具有特异性，需要与电镜观察、PCR、间接免疫荧光（IFA）等检测技术结合使用，这样不仅可以提高检测的特异性，也能减少检测时间。

1.1 鸡胚接种 鸡胚接种是分离IBV最常用的方法，将处理好的病料接种9～11日龄SPF鸡胚，接种后36～48h，尿囊液中的病毒滴度达到最高，非胚适应性野毒株出现峰值的时间可能会延迟。当出现典型侏儒胚且尿囊液血凝试验（HA）和杂菌检验呈阴性时，即初步认为分离出IBV。李康然等[2]（1990）从广西地区 13 个鸡场分离出 C、G、Z、Q四株病毒，接种鸡胚后在6～7d出现了矮小、蜷缩的侏儒胚。IBV引起的鸡胚病变因毒株和代次的不同而有所差异。通常毒力强、传代次数高的毒株引起的病变更加明显。鸡胚接种虽然是分离IBV的常规方法，但费时、费力，势必会延误病程的及时诊断和治疗。

1.2 气管环接种 气管环培养是IBV分离、效价测定和血清分型的有效方法，特别适合观察IBV对气管的破坏作用。一般采用18～20日龄的SPF鸡胚制备气管环，接种气管环后36h左右即可以看到纤毛摆动停止，上皮细胞脱落、萎缩等病变，并在3～5d左右病毒达到最高滴度。对于初次分离的临床病料，不需在气管环上适应，即可引起气管纤毛摆动停止或活性下降等。杨娜等[3]（2010）将鸡胚接种和气管环接种相结合，把被IBV感染的尿囊液注入气管环培养液中，传一代即可证明IBV的存在，大大缩短了IBV的分离时间。

1.3 细胞培养 IBV在细胞中复制并诱导细胞病变效应（CPE）必须有一段适应过程，使用常规细胞进行培养往往不能从病料中分离病毒，但Vero细胞、气管上皮细胞（CTE）、鸡胚肾细胞（CEKC）等对适应性IBV毒株有很高的敏感性。IBV在细胞上的CPE主要有细胞变圆、形成合胞体等。孙裴等[4]（2008）将 IBV M41毒株接种于 CTE细胞，72h时有30%以上的细胞脱落，出现明显的CPE。李华伟等[5]（2011）将其接种于CEK细胞，36h后细胞开始变圆、固缩、脱落聚集成团等病变。

1.4 电镜检测 IBV的电镜检测直观、准确，一般与以上三种培养方法相结合从而鉴定IBV的存在与否。将感染IBV的鸡组织器官或分泌物做常规负染色进行电镜观察，可见IBV病毒粒子呈球形，直径为80～120nm，有囊膜，囊膜表面有纤突。电镜观察直观、快速，但电镜仪器昂贵，一般实验室很难普及。

2 血清学检测方法

2.1 血凝和血凝抑制试验（HA&HI） 血凝和血凝抑制试验可用于检测IBV抗原及抗体。IBV本身没有血凝性，但经一定处理后会产生血凝现象。Bingham[6]（1975）首次发现IBV M41株经过Ⅰ型磷脂酶C（PLC I）处理后能凝集鸡红细胞，而这种凝集作用可被特异性的抗血清所抑制。King等[7]（1983）建立IBV的HI试验，并将其标准化，从而为IB的诊断提供了一种简单、快速、特异性强的血清学方法。吴延功等[8]（1994）证实IBV用PLC I的兔A型魏氏梭菌培养液处理后同样能凝集鸡的红细胞。陆苹等[9]（2003）研究发现，用1%胰蛋白酶处理尿囊液来制备抗原，结果检测IBV的灵敏度和特异性更强。在国外HI试验已成为一种标准的诊断方法，与病毒中和试验（VN）相比可能更易更早检出抗体。但由于HI抗原制作复杂，抗原效价不稳定，病毒浓度与HA滴度不呈线性关系，HI滴度与保护力在免疫期无相关性等缺点，故该方法用于IBV免疫监测仍需进一步完善和深入探讨。

2.2 琼脂扩散试验（AGP） AGP试验具有操作简便、快速、特异性强、费用较低、不需要特殊仪器等优点，已被广泛应用于IBV抗体检测。封文海等[10]（1993）、王红宁等[11]（1996）先后认为 AGP 可用作IB快速定性和定量检测。杜恩歧等[12]（2003）用IBV LX4毒株N基因进行诱导表达后获得包涵体，纯化蛋白后免疫所得多抗与不同型毒株进行AGP，结果表明该抗体可与不同毒株发生反应，说明重组蛋白可作为群特异性诊断抗原用于IBV的诊断。IBV抗原的处理和浓度是AGP成功的关键因素。AGP抗体阳性率与病毒的致病性、病毒的感染剂量、鸡的日龄及感染时抗体的存在状态有关。群特异性的AGP快速而简单，花费少，只需要极少的实验器械，即可获得最佳的结果，但AGP的敏感性差，不能区分疫苗株和自然感染毒株等缺点而限制了其在实际中的应用。

2.3 病毒中和试验 （VN） VN试验是鉴定IBV的经典方法，可在鸡胚、CEKC或气管环培养物上进行，广泛用于IB野毒株的分离和鉴定及血清分型。吴延功等[13]（1995）通过对IBV在CEKC和气管环组织培养物上的适应性的比较，证明气管环比CEKC更适用。吴全忠等[14]（1998）用鸡胚气管环培养物的纤毛运动为指示系统，进行了不同IBV毒株与血清的交叉中和试验，证实气管环中和试验比鸡胚VN更准确、简单、直观。秦卓明等[15]（2000）用气管环交叉VN试验成功地鉴定IBV山东分离株的血清型。气管环中和试验虽然灵敏度和特异性均较好，但是操作复杂、费时、价格昂贵且需要较高的实验室条件。

2.4 荧光抗体技术（FA） FA法可用于IBV抗原抗体检测及抗原组织定位的研究。封文海等[16]（1994）建立 IFA 法检测 IBV。 朱建国等[17]（1996）建立了单抗介导的IFA法。刘兴友等[18]（1997）采用胰酶分散法制备抗原，建立IFA法，检测结果与冰冻切片制备抗原建立的IFA完全一致。刘思国等[19]（2000）应用IFA法对IBV感染后SPF鸡不同脏器进行了跟踪检测。结果发现，在IBV感染后的第7d，在气管、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等组织细胞中均不同程度地出现特异性的荧光。FA方法具有直观、特异等特点，在抗原定位上具有独特的优点，但需荧光显微镜及较严格的时间限制。

2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA具有特异性强、敏感性高、操作简便以及在短时间内可以进行大量样本的检测和结果可靠等优点，已被广泛应用于IBV抗原和抗体的检测。IBV由4种主要结构蛋白组成：核蛋白（N）、纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）和小囊膜蛋白（E）。N蛋白在进化上保守，诱导产生较强的交叉免疫反应，可以检测群特异性抗体。S蛋白是IBV最重要的保护性抗原，可以被裂解为S1、S2两个糖基化蛋白，S1蛋白是诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，且在各血清型之间具有交叉反应。M蛋白为群特异性蛋白，保守性高，在IBV检测中起着重要作用。E蛋白在IBV感染细胞中大量存在，与感染细胞的细胞凋亡有关，另外在病毒复制过程中，E蛋白与M蛋白协同作用，参与病毒样颗粒 （virus-like particle，VLP）的形成和出芽，VLP在IBV的黏膜免疫中发挥作用。

2.5.1 间接ELISA 间接ELISA是最常用的抗体检测方法，主要用于IgM和IgG抗体的检测。李锋等[20]（1992）、磨美兰等[21]（2009）用纯化的 IBV 全病毒蛋白作为包被抗原建立了检测IBV抗体的间接ELISA，其灵敏度是VN的2.3倍，AGP的188倍。许兰菊等[22]（1997）用同种方法建立的ELISA检测54群发病鸡，其抗体阳性率为100%。王君玮等[23]（2004）建立了检测IBV IgG和IgM抗体的间接ELISA。陈萍[24]（2005）、付润饶[25]（2014）、郑卫峰等[26]（2015）也先后建立了IBV全病毒抗原的间接ELISA方法，用于疫苗免疫后鸡血清中特异性抗体的检测。Chen 等[27]（2003）、 郝春丽[28]（2007）、 呼延蓉[29]（2010）、李广兴等[30]（2014）先后以 IBV 重组表达的N蛋白作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法，为IB快速诊断和流行病学研究奠定了基础。Gibertoni等[31]（2005）、孙罗美等[32]（2012）、苗立中等[33]（2017）先后以 IBV 重组表达的S1蛋白作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法。王宏俊等[34]（2003）利用重组N蛋白作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法。Wang等[35]（2002）利用重组IBV的N蛋白和部分S蛋白作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接 ELISA。Ding等[36]（2015）人工合成了选自IBV的S蛋白、M蛋白和N蛋白的多片段抗原作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA。间接ELISA为IBV的免疫抗体监测、临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供了一种敏感、特异、高通量的检测技术。

2.5.2 斑点ELISA（Dot-ELISA） 该方法是一种以硝酸纤维素膜等固相化基质膜为载体的ELISA，用于检测抗体或抗原。刘红等[37]（1998）建立了Dot-ELISA检测IBV，对病毒的最低检出量为0.0124mg/ml，不仅检测纯化的病毒，而且可直接用于检测鸡胚尿囊液或病变组织，可作为IBV的早期诊断。王乐元[38]（1993）成功建立了检测IBV抗原的间接Dot-ELISA，对IBV抗原的最低检出量为 1.36μg/ml。 王富晓等[39]（1999）建立了单克隆抗体介导的夹心法Dot-ELISA，对IBV抗原的最低检出量为 0.5μg/ml。 阎芳等[40]（2000）将生物素、亲和素系统与Dot-ELISA相结合，建立了ABCDot-ELISA检测IBV的方法。对自然感染和人工感染的病料均取得了较好的检出率，分别达到70%和85%左右，显著高于AGP。云长晔等[41]（2000）建立的Dot-ELISA方法，检测 IBV鸡胚毒40份，阳性检出率100%。人工感染发病鸡的气管、泄殖腔拭子样品各50份，阳性检出率分别为100%和92%。

2.5.3 夹心ELISA及双抗体夹心ELISA 该方法分别利用多克隆抗体、单克隆抗体（MAb）作为一抗、二抗，并采用标记抗鼠IgG的为指示系统建立的ELISA，用于IBV抗原早期感染的检测，并且可以区分病毒株或血清型。该法比较适合于检测病料和感染鸡胚尿囊液中的IBV，要求病料中病毒含量TOC半数感染量为10-5时方能够检出。刘滨东等[42]（1997）用MAb夹心ELISA检测结果明显高于传统的鸡胚气管环法及鸡胚传代方法。王川林等[43]（2001）认为以单抗包被反应板要优于用多抗、病毒包被反应板。季文彬[44]（2017）建立检测IBV的双抗体夹心ELISA，特异性好、可重复且检测结果可靠，为IB防控提供了良好的诊断方法。

2.5.4 捕获ELISA 白妍[45]（2016）利用制备的IBV B11株单抗成功建立和优化抗原捕获ELISA方法，具有很好的敏感性和特异性，适合大规模样本的快速检测。

2.6 胶体金免疫层析技术（GICA） 王泽霖等[46]（2005）采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG，建立了一种对IBV进行检测的银加强金标免疫技术（SECGA），该技术不需特殊设备，快速、简便，被认为是微生物诊断技术标准化最有前途的新技术之一，但其缺点是对金标二抗的浓度和活性要求很高。苏磊等[47]（2008）利用IBV单抗及兔抗IBV多抗建立了用于检测IBV的免疫胶体金诊断试纸条技术，该技术通过与IBV双抗夹心ELISA法比较，具有较高的特异性、灵敏性、稳定性，并且可在加入待检样品15min后即可判定结果。夏昕[48]（2010）、郑卫峰[49]（2016）成功制备了能 检测 IBV的免疫胶体金快速检测试纸条，为IB的早期诊断和防治以及与其它禽类呼吸道感染的快速鉴别诊断提供了有力的技术手段。

2.7 对流免疫电泳技术（CIE） 王红宁[11]（1996）在国内首先采用CIE技术对128份人工感染鸡样品进行IBV抗体检测，与AGP试验相比，极大地提高了试验的灵敏度（16～20倍），适宜于鸡群的大规模抗体监测。王川庆等[50]（1997）利用CIE技术来检测IB，结果证明该技术与VN、HA/HI等相比可缩短20倍以上的时间，可用作IB的快速定性和定量检测，但该方法还不能做血清分型和区分强、弱毒株。

2.8 斑点免疫金测定法（DIGFA） DIGFA是在Dot-ELISA方法的基础上发展起来的一种新的免疫学技术，不需要特殊试验条件，结果客观，肉眼易于判断，是一项很有前途的新技术。李新生等[51]（1996）首次进行了DIGFA法检测IBV的研究，结果表明DIGFA法对IBV的早期诊断具有简便、灵敏、快速、特异性强和重复性好等优点。该法在实现商品化后，适合于广大基层单位推广与应用。

3 分子生物学检测方法

3.1 RT-PCR RT-PCR方法具有敏感、特异、快速等特点，既可利用通用引物检测不同来源、不同血清型的IBV，对于某些差异较大的毒株也可通过设计型特异性引物区分不同的IBV毒株。针对变异率较高的S1蛋白等设计引物可以实现血清型或基因型的特异性扩增；而针对N、M等保守区域设计引物则可以实现群特异性扩增。Keeler等[52]（1998）设计了S1基因的通用性引物和6个型特异性引物，成功扩增了来自于北美、欧洲及澳大利亚的共31个分离株的S1基因并且进行了区分。Adzhar等[53]（1996）针对IBV的S2基因和N基因设计了通用性的7对引物，检测了来自欧洲、日本和美国的IBV病料。王林川等[54]（1994）率先在我国采用RT-PCR技术检测广东分离的IBV。陆苹等[9]（2003）、刘金朋等[55]（2011）等根据 IBV N 基因序列设计引物，建立了RT-PCR方法。于申业等[56]（2007）根据IBV 793/B株S1基因序列设计引物，建立了检测IBV 793/B的RT-PCR方法。周生[57]（2002）对四川分离的多株IBV S1基因和N基因用RT-PCR进行了扩增，表明建立的方法适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。孟凡磊[58]（2007）根据 IBV N基因和 S1基因（793/B）分别设计两对引物，建立了双重RT-PCR方法，只需一次PCR反应，就能检测IBV和鉴定出793/B型。程晓霞等[59]（2009）根据 IBV M基因设计引物，建立了检测IBV的RT-PCR方法。姚四新等[60]（2013）根据IBV ZZ20043a、3b及E基因序列设计引物，建立了检测IBV ZZ2004变异株的RT-PCR方法。潘盛[61]（2006）通过在IBV非结构基因3abc的保守区域设计引物，建立了RT-PCR并组装成试剂盒。磨美兰等[62]（2009）建立了检测IBV的巢式 RT-PCR方法。高文倩等[63]（2017）根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物，建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RTPCR方法，可以快速鉴别IBV强毒株和弱毒疫苗株，为IBV检测提供了新的技术支持。

3.2 荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RTPCR与普通RT-PCR相比，其特异性和灵敏度都更高，为IBV感染的快速检测提供了一种新的方法。崔沛[64]（2007）首次在国内建立了对IBV的实时荧光RT-PCR检测体系。刘乔然等[65]（2008）、磨美兰等[66]（2011）、王鹏等[67]（2013）先后根据 IBV N 基因设计引物建立了检测IBV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。于新友等[68]（2015）根据IBV M基因保守序列设计引物，建立了IBV SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。苗立中等[69]（2017）根据IBV E基因设计引物，建立了SYBR GreenⅠRT-PCR方法。梁耀峰等[70]（2012）根据 IBV N基因序列设计特异的H52株荧光定量RT-PCR检测引物和Taq Man-MGB探针，建立了快速检测IBV H52株检测方法。屈素洁等[71]（2014）在国内首次针对IBV的N基因和NDV的NP基因设计引物和TaqMan探针，建立了同时检测IBV和NDV的双重荧光定量RT-PCR，实现了多种病原的同时检测。

3.3 环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）RT-LAMP技术是建立在基础RT-PCR基础上的一种新型核酸检测方法，具有简便、快速高效、敏感性强等优点，适合基层业务部门及养殖场的检测，为IBV感染的快速检测提供了新方法。刘程[72]（2012）、刘宇卓等[73]（2013）先后根据 IBV 的 M 基因设计引物建立了RT-LAMP方法，其检测极限比建立的RT-PCR更高，具有良好的特异性和敏感性。马利[74]（2012）根据 IBV的 5a+5b基因序列设计引物；范瑾[75]（2013）根据IBV M基因设计引物；鲜思美等[76]（2014）根据IBV N基因设计引物，分别建立了检测IBV的RT-LAMP方法。

3.4 核酸探针技术 核酸探针技术具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。 Kwon[77]（1993）应用PCR和生物素标记的DNA探针检测了接种IBV的SPF鸡气管中的IBV基因组，发现此法敏感度比电镜观察高。朱国强等[78]（1996）利用此技术确诊了江苏流行的腺胃型IB。王泽霖等[79]（2000）用其标记IBV标准强毒株M41株和T株的S1基因探针与IBV的RNA提取物进行斑点杂交，结果表明该探针与已知IBV毒株均呈阳性反应且具有较高的敏感性。孟凡磊等[80]（2007）根据IBV N基因序列设计引物，成功制备出地高辛标记的IBV核酸探针，对IBV的最低检出量为10pg。莫胜兰等[81]（2007）用地高辛标记IBV pol基因的保守片段并制作探针，克服了RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性。

3.5 基因芯片技术 基因芯片技术是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，检测疾病具有高通量、并行性和结果判读客观、准确和信息化等特点。曹三杰等[82]（2006）首次成功制备了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片。赵玉佳等[83]（2015）构建了联合检测NDV、IBV、ILTV 的基因芯片。 杨国淋等[84]（2016）则在此基础上将不对称PCR和基因芯片结合，同时增加cy3标记引物的浓度，从而提高了芯片探针与靶基因的杂交效率和灵敏度。基因芯片技术克服了常规生物学方法仅能对少数靶标基因检测的缺点，减少了对结果判断的主观因素，能够同时对多种混合感染的疾病进行诊断。

3.6 限制性酶切片段长度多态性技术（RFLP）RFLP是一种通过病毒基因限制性酶切图谱进行分型的方法，该法新颖，重复性好，可用于IBV从分子水平上进行了分型。Kown等[76]（1993）对IBV S1基因的RT-PCR扩增产物，经限制性内切酶消化后电泳，根据电泳图谱对25株IBV进行了分类，结果得到了与VN相一致的结论。王林川等[85]（1997）、磨美兰等[86]（2001）先后用 RFLP 分析对IBV进行了血清分型研究。

4 小结

本病目前尚无特效疗法。尽管已有多种商品化疫苗用于IBV免疫预防，但由于IBV的基因组核酸在复制过程中易发生突变和高频重组，从而导致该病毒血清型众多，变异株不断出现，且不同血清型之间交叉保护力弱，常导致免疫失败，使得IB难以控制，给世界养禽业带来巨大经济损失。临床上IB与新城疫、禽流感、传染性喉气管炎、传染性鼻炎等病的症状类似，单凭临诊剖检往往不能做出准确的诊断，必须依靠实验室诊断。目前IB病原学、血清学、分子生物学检测方法的研究在广度和深度上已有了较大进展，但各种方法各有优缺点，每一种方法都难完全做到快速、简便、灵敏、特异、经济和实用。在检测中可以根据实际需要，结合实际条件和操作经验，选择适宜的检测方法或将几种方法结合起来用，以取得很好的效果。相信随着IB实验室检测技术的不断研究与应用，尤其是IBV分子生物学研究的更加深入，IBV的检测技术将会得到不断发展和完善。