液-液萃取结合G C-M S对牛栏山清香型白酒微量成分的分析

王 瑛，周 森，朱婷婷，王 宇，梅兴华，魏金旺

(北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301)

中国白酒是指以粮谷为主要酿造原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒[1]。白酒的酿造历史悠久，可以追溯到距今4000多年前的龙山文化时期[2]。在几千年的传承发展中，中国白酒形成了自己独有的固态发酵（Solid-state fermentation）方式和蒸馏工艺（Distillation），与法国的白兰地（Brandy），俄国的伏特加（Vodka）和苏格兰的威士忌（Whisky），金酒（Gin），朗姆酒（Rum）并称为世界六大蒸馏酒[3]。中国白酒由于独特的风味和口感受到消费者的亲睐。牛栏山二锅头采用东北地区优质高粱品种为原料,精心挑选小麦和豌豆低温制曲,将传统工艺与现代酿造技术相结合,经过复杂而科学的发酵工艺,生产出色泽清亮透明、清香纯正、醇甜柔和的白酒[4]，是北京白酒的代表产品,并成为国家级非物质文化遗产。据文献报道[5-6]，白酒中已鉴定的微量成分不少于300种,但其含量仅占约2%。这些微量成分虽然含量极少，但对白酒质量却有极大影响，决定白酒的香气和口味,构成白酒的不同香型和风格，同时也是白酒中健康因子的来源[7]。随着检测技术的发展，萜烯是近几年发现普遍存在于白酒中的微量成分。萜烯类化合物具有广泛的生物活性，也是白酒中重要的健康因子[8]。对于这些成分的鉴定，液-液萃取法具有萃取效率高和富集成分种类多的优点，结合气相色谱-质谱联用技术所具有的强大分离和定性能力成为该研究领域最有效的分析手段。本研究以牛栏山清香型白酒为原料,采用多溶剂液-液萃取方法利用气相色谱-质谱联用技术对其微量组分进行鉴定,旨在为牛栏山白酒微量成分的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛栏山二锅头酒原酒70%vol（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂生产）。

1.2 主要仪器与试剂

岛津GC-MS-QP2010 Ultra气相色谱仪（日本岛津公司）；DC-12氮气吹扫仪（上海安谱科学仪器有限公司）；赛墨飞世尔PLR-1006冰箱(Thermo Fisher Scientific公司)；分液漏斗；有机试剂均为色谱纯（Merck,德国默克公司）。

1.3 实验方法

液液萃取：量取100 mL白酒酒样，分别量取100 mL正己烷萃取1次,然后用100 mL乙醚再萃取1次，合并有机相。最后将剩余酒样用超纯水稀释至10%vol，加入NaCl溶液至饱和，再用100 mL戊烷∶乙醚1∶1(v/v)进行最后一次萃取，将3次萃取的有机相合并，通过氮吹仪浓缩至2 mL，冰箱存储，备用。

GC条件：FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分离的色谱条件：气相色谱进样口和检测器温度为250℃，载气为氦气，流速2 mL/min；进样量为2 μL，不分流进样。

色谱柱升温程序：初温50℃，保持2 min，以3℃/min升至170℃，保持2 min，再以6℃/min升至230℃，保持15 min。HP-5柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm)分离的色谱条件：初温50 ℃，保持2 min，再以6℃/min升至230℃，保持15 min。其他条件同FFAP柱。

质谱条件：EI电离源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；扫描范围：35～500 amu。

定性方法：将分离得到的单组份色谱峰对应的质谱图与工作站NIST Library谱库中质谱图进行检索匹配,匹配率与鉴定的相对准确度大于85%。

2 结果与分析

通过液液萃取-结合气相色谱-质谱联用分析发现牛栏山清香型白酒主要是由酯类化合物、醇类化合物、酸类化合物、醛类化合物和烷烃类化合物、萜烯类及酚类化合物等构成。由表1可以看出，在牛栏山白酒中检出49种酯类成分，是主要香味物质。其包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯等。这些酯类主要来源于酒醅发酵过程中酿酒微生物对粮食作物中淀粉、脂肪、蛋白质等生物大分子的代谢。实验对本厂清香型白酒发酵过程中主体风味物质的微生物代谢分析认为，清香型白酒的重要风味物质乙酸乙酯主要来源于酿酒酵母。共检测到19种醇类物质，主要是高级醇。醛酮类物质共检测到11种，主要有己酮、庚酮、壬酮及壬醛、癸醛等。酸类是牛栏山白酒重要协调成分，同时也具有扩张血管、延缓血管硬化的功能，并具有杀菌抗病毒的作用，能促进胃液分泌，降血脂和胆固醇的作用，但是由于萃取过程中用的都是非极性溶剂，对酸的提取效果较差，所以只检测到6种长链酸。在酒样中检测到5种酚类物质及8种萜烯类功能因子，其中酚类化合物可能大部分是来源于木质素的水解产物，萜烯类物质可能是来源于酿酒原料及发酵过程中的微生物代谢产生。这类化合物具有抗癌症[9]、抗病毒[10]以及抗炎症[11]等活性。上述微量成分构成了牛栏山清香型白酒的主体成分，赋予其独特的风格特征。

3 结论

本实验从白酒最本质的特征——微量化合物成分研究着手，采用液液萃取结合GC-MS分析技术对牛栏山清香型白酒的微量成分进行初步研究，共有157种化合物被检出。鉴定了其中的109种化合物。包括49种酯类化合物，19种醇类、6种醛类、5种酮类物质、6种酸类、11种烃类、8种萜烯类、5种酚类化合物（见表1）。这些微量成分的鉴定将有助于确认牛栏山清香白酒的特征风味物质，进而揭示清香型牛栏山白酒的关键风味物质和本质特征。实验确定牛栏山白酒中关键微量化合物，为清香型白酒的风味成分提供理论依据，对全面认识和理解白酒的风味组分的物质基础和风味特征具有重要价值。为进一步深入探索特征风味物质的形成途径和机理，强化白酒中的主体风味物质，奠定理论基础。