甜菊糖的生物合成、转化与糖基化

吴则东 ，马龙彪 ，周艳丽 ，张文彬

（1.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；

2.黑龙江大学农业资源与环境学院，哈尔滨150080）

甜叶菊是产于巴拉圭与巴西的多年生主要的保健用草本植物，含有的调节和维持人体内各种代谢过程所必需的重要营养素和矿物质[1]。甜菊糖（steviol glycosides，SGs）以纯天然、零卡路里、热稳定、对血糖无影响、非可发酵、酸碱性稳定、比普通糖甜150～300倍、防龋齿、无褐变反应和无脂肪与碳水化合物十大优点，受到全球消费与开发者的青睐[2]。甜叶菊叶片的天然成分主要是贝壳杉烯二萜苷：甜菊糖苷（stevioside，STV），莱鲍迪苷A（Reb A）、B、C、D、E，杜尔可苷A和甜菊双糖苷。其中较甜的四环二萜甜菊糖是STV和Reb A，这些苷是由一个二萜贝壳杉烯骨架连接大量葡萄糖单元组成。几乎30种贝壳杉烯二萜苷已从不同种甜叶菊植物中提取，通常被称为甜菊醇糖苷（steviol glycosides），即以甜菊醇（steviol，ent-13-羟基贝杉壳烯酸）为基础配糖苷，C19酯键参与C19安息香酸功能和葡萄糖单元之间连接，C13羟基团与葡萄糖、木糖、鼠李糖结合形成乙醚键。Reb A比STV有更多的葡萄糖[3]。葡萄糖和槐糖基残基存在于STV，与糖苷配基甜菊醇连接，最后呈现环戊烷多氢菲的骨架。甜菊醇（steviol）的C4和C13分别与β-葡糖基和β-槐糖基团连接。Reb A与STV具有相同的基本结构，唯一不同的是葡糖基-（1-3）-槐糖基残基替换了槐糖基残基[3]。STV（三糖苷甜菊醇）是最主要的贝壳杉烯型二萜苷，占干叶含量的3%～8%，Reb A比其它甜菊糖更甜、味道更美[3]。

1　甜菊糖生物合成途径

甜菊叶的甜度是由于次生代谢物甜菊糖的存在。STV和Reb A是各种甜菊糖（SGs）的重要代谢产物。甜菊糖的生物合成途径涉及16个步骤，是由众多的酶催化，其中4个UDP-糖基转移酶（UGTs）为UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1 和贝壳杉烯酸-13-羟化酶（KAH）[4]。与赤霉素（GA）的生物合成途径有关[5]。甜菊糖（SGs）主要存在于甜叶菊叶片中，少量在茎中，根中几乎没有[6]。甜菊糖的生物合成主要涉及7个步骤与MEP（2-cmethyl-d-erythritol-4-phosphate）的异戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和香叶基焦磷酸（GGDP）合成途径相似[7]；随后，接下来的4个步骤与赤霉素（GA）的生物合成途径中涉及到从GGDP到贝壳杉烯酸的合成相似；最后5个步骤包括甜菊醇糖苷（steviol glycoside）的生物合成途径[3]。

在柯巴基焦磷酸（CDP）合成酶（CPS）存在下，GGDP最初通过质子化引发环化将CDP转换为甜菊醇（steviol），随后，贝壳杉烯合成酶（KS）产生贝壳杉烯。进一步，通过3步反应贝壳杉烯经贝壳杉烯氧化酶（KO）氧化为异贝壳杉烯酸，像GA的生物合成一样[8]。在甜叶菊植株的花、叶、肉质茎和嫩枝中KO含量极高[5]。最后，通过异贝壳杉烯酸-13-羟化酶（KAH）作用将异贝壳杉烯酸羟基化。在这一步中，甜菊糖（SGs）生物合成与赤霉素（GA）生物合成开始分支[9]。

在细胞质中，糖苷配基甜菊醇由不同的糖基转移酶（UGT）糖基化。在甜菊醇有两个羟基团，分别在C-4羧基的C-19位和C-13位。在UGT85C2催化下开始对甜菊醇的C-13糖基化产生甜菊醇单糖苷，再糖基化产生甜菊醇双糖苷，UGT催化此步还没有确定。最后，在UGT74G1催化下将甜菊醇双糖苷C-19糖基化形成甜菊醇三糖苷（即STV）。那么，Reb A是由UGT76G1酶催化下将STV的C-13糖基化生成的[9]。

2　STV糖基化为Reb A

Reb A因其具有高甜度，口感好，口味好，无任何不良余味，是商业上最受青睐和开发价值的SGs，因此用酶催化甜叶菊叶片将STV糖基化努力提高Reb A的含量。试验表明，添加1%可溶性淀粉、1%纤维素酶到反应混合物（0．1 M 磷酸钠缓冲液 pH 4．6），叶片与缓冲液比为 1∶15，然后在 50℃孵育，在 100～120℃、10 kPa压力和90 r/min 10～15 min将甜菊叶加压热水提取（PHWE）SGs。结果证实，STV的糖基化转化为Reb A，使Reb A含量从4%提高到66%。进一步净化多柱色谱分离得到95%纯Reb A。Reb A浓度与α-葡萄糖苷酶有关，抑制活性IC50=35．01lg/mL。因此，STV转化Reb A的过程简单、廉价和环保，具有商业潜力[10]。

甜菊叶经纤维素酶预处理水解叶细胞壁，释放胞内的甜菊醇糖苷、α-淀粉酶和转糖苷酶[11]。释放的α-淀粉酶水解可溶性淀粉为葡萄糖释放到介质中，这些葡萄糖分子然后转移到STV的C-13位由葡糖基转移酶催化而获得高收益的Reb A，从而提高提取的SGs甜度[12]。当添加纯的STV到反应混合物（含有纤维素酶和可溶性淀粉）中做底物，转糖基化并没有进行。这可能是反应介质中由于缺乏胞内酶（α-淀粉酶和糖基转移酶）。这也证明了介质中纤维素酶不负责STV的转糖基催化。经纤维素酶预处理，叶片释放的糖基转移酶负责催化转糖基化反应，从而提高Reb A的生产[10]。

在人类，味觉接收有5种：甜、甘、苦、咸和酸。味觉受体细胞（TRCs）和信令单元已被确认在口腔、味蕾在舌[13]。甜味受体（STR）属于G蛋白偶联受体C类（C-GPCR）家族[14]。在异种受体hTAS1R2 and hTAS1R3蛋白相结合激活下，开始感觉甜味[15]。与甜味的单受体探测比，苦味受体属于G蛋白偶联受体的卷曲受体家族[16]。它们表现出独特的，但部分重叠分子接受范围，因为人类苦味hTAS2R基因家族的25受体已被转导在染色体簇 5p15、7q31 和 12p13[17]。 hTAS2Rs的氨基酸长 290～333 个，有 7 个跨膜螺旋（TM1～TM7），位于短胞外氨基端和胞内羧基末端[18]。在25个受体中，hTAs2R4受体受STV和Reb A的活化作用参与苦味接受[19]。但是，苦味背后的分子结构机制依旧不为人知。酶法合成引起了相当的重视，在绿色环保发展起重要作用。酶法改性的过程中，在一个糖残基转移到另一个糖苷期间形成糖苷键[20]。R Singla等已经开发出一种苦味受体同源性模型和测定苦味受体活化配体的结构，提出了STV酶生物转化Reb A的合成策略，以β-1,3-葡聚糖酶合成了Reb A。酶的糖基化需要两个步骤，第一步是β-1,3-葡聚糖酶将凝胶多糖做供体分解为葡萄糖部分，第二步是在STV的C-3位置有选择性进行β配置。温度、pH值、时间、多糖和酶的浓度在产品产量起着重要的作用。STV 与多糖的比例为采取 1∶2，优化反应条件：55℃、pH 4．5、柠檬酸缓冲液，反应时间为 3h。在 3．425单位/克酶活性下反应产物达最大产量，反应产物经柱层析纯化，转化率为62．5%[21]。

3　甜菊糖的生物转化

对贝壳杉烯二萜苷的生物转化研究表明，人类和动物中STV和Reb A可安全地代谢而未被吸收利用[22]。由于STV的分子量高，人体小肠不容易吸收，不易被胃肠道消化酶分解为甜菊醇。STV或通过盲肠或结肠的菌群降解产生游离甜菊醇，或在肝脏进一步转化为葡萄糖醛酸衍生物通过尿液排出[23]。体外方法测定各种消化酶消化STV的研究表明，在肠道的菌群没有消化酶消化STV，但将其水解产生甜菊醇和甜菊醇-16-α-17-环氧化物，最后，甜菊醇-16-α-17-环氧化物完全转化为甜菊醇和甜菊醇葡萄糖醛酸从尿液中排出[24]。

Reb A通过结肠微生物代谢为STV，进一步转化为葡萄糖分子和甜菊醇。结肠的细菌或Bacteroides sp．将释放的葡萄糖分子利用而不被身体吸收进入血液和代谢成分基本上离开身体[25]。甜叶菊的最终代谢产物是甜菊醇，通过人的粪便，并不改变代谢浓度。主要的甜菊糖（STV和Reb A）在肝脏吸收和葡糖醛酸化，一小部分留下结肠做粪便排泄，葡糖苷酸是释放在血液通过肾脏过滤进入尿液[26]。在个别物种STV转化为甜菊醇比Reb A转化为STV更快速[3]。此外，定量和定性在大鼠机体和人体的肠道（菌群）中都发现了相似之处。

4　甜菊糖苷的未来微生物工厂化生产

Reb A甜度虽高，但高浓度回味仍具苦味，Reb C的甜度仅是葡萄糖的30倍，含量低的五糖苷Reb D和六糖苷Reb M及其共混物甜度高达蔗糖的350倍，并极大降低了苦味。Reb D明显比Reb B甜且苦味低，与Reb A、B相比，Reb M具高甜度、快速和干净的味道，且苦味极低。这些特性使Reb D和Reb M成为优质的高潜力的天然甜味剂。Reb D和Reb M在甜叶菊叶含量极低（约0．5%），从甜叶菊中提取是不切实际和昂贵的。STs的Reb D和Reb M生物合成途径已在酵母中成功表达，微生物提供了Reb D和Reb M的异源生产替代[27]。因此，利用微生物实现工厂化生产下一代高甜度甜菊糖甜味剂，是未来的发展方向。

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