细胞外囊泡在男性勃起功能障碍治疗领域的应用进展

吴 寒 综述 林浩成 姜 辉 审校

1. 北京大学第三医院泌尿外科（北京 100191）;2.北京大学第三医院生殖医学中心; 3.北京大学第三医院男科

勃起功能障碍（ED）是老年男性常见的性功能障碍疾病。其发病与年龄、生活方式及心血管疾病等有关。目前存在多种治疗ED的方式，包括口服5型磷酸二酯酶抑制剂（PDE5Is）、经尿道给药、低强度体外冲击波、海绵体注射治疗、真空负压吸引及假体植入等，近年来干细胞治疗概念在医学领域逐渐成为研究的热点，尤其在损伤修复领域，干细胞治疗方兴未艾，然而关于其疗效发挥的具体作用机制仍存在争议。干细胞本身具有多向分化潜能，同时还可能通过旁分泌机制发挥作用。近年来干细胞治疗的旁分泌作用正越来越受到学界关注，已有大量研究证实其在干细胞治疗过程中发挥的重要作用。目前认为干细胞旁分泌可能通过细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）方式实现，本文将回顾EVs研究相关进展，并探讨其应用于ED治疗的可能性。

一、ED的治疗

（一）现有的ED治疗手段

过去的几十年间，由于对勃起和ED机制了解的不断深入，先后出现多种ED治疗手段[1]。虽然目前口服PDE5Is已成为一线治疗方式，但是其仍然存在一定局限性，如对同时服用硝酸盐类药物的患者存在诱发低血压的风险；部分患者对药物本身的副作用难以耐受；此外，高昂的药品售价也在一定程度上限制了其应用[2]。现存的其他治疗手段，包括经尿道给药、海绵体内注射、真空吸引辅助勃起、海绵体假体植入等，均存在特定适应证和风险[3]。因此近年来学界对于探究包括基因治疗和干细胞治疗在内的新的、可治愈ED的治疗方式的热情与日俱增[4,5]。

（二）ED的干细胞治疗

近年来，随着ED逐渐被大众认知并成为世界性的健康问题，ED的干细胞治疗吸引了越来越多的注意。目前已证实干细胞对肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等具有良好的治疗效果[6-9]。

阴茎勃起主要依赖于海绵窦的充血，后者内衬单层内皮细胞（ECs），并被多层环状和纵行的海绵体平滑肌（CSMCs）包绕。生理状态下阴茎勃起的实现主要依赖一氧化氮能神经参与的一氧化氮/环一磷酸鸟苷（NO/cGMP）通路实现。多种病理因素通过损害上述3种勃起相关结构造成ED，常见的诸如前列腺癌根治术后的海绵体神经损伤、糖尿病造成的微血管病变和内皮损伤等[10]。干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，能够向包括内皮细胞、平滑肌细胞、Schwann细胞和神经元细胞在内的多种细胞类型分化[11]，因此具备针对器质性ED各种损伤进行靶向治疗的潜在价值。

已有许多临床前研究证实多种干细胞能够有效改善ED患者的勃起功能[12]，然而干细胞移植的安全性问题，尤其是移植后肿瘤形成风险也一直为学界所关注。首先目前认为多种肿瘤的形成起源于干细胞，因此移植后良性肿物或者侵袭性恶性畸胎瘤形成风险不可忽视。尽管目前已有相当数量的临床前研究对干细胞移植后风险进行了评估，然而由于动物模型往往很难准确预测移植细胞在人类体内的最终结局；其次在某些临床应用中，往往需要多次大量（通常以数十亿记）使用移植细胞，在这样的数量级面前，很难保证干细胞制品中不包含未分化细胞；最后，同传统的药物治疗不同，普通药物在人体内存在半衰期且通常清除较快，但干细胞治疗设计之初就需要稳定数量的细胞在人体内长期发挥作用，而目前无论在动物还是在人体内，对注射后的移植细胞进行长期监控仍然缺乏有效手段，这样就更增加了移植干细胞的不确定性[13]。鉴于此，一类由细胞产生的、由多种生物活性成分构成、能够传递细胞间信号并具有细胞间成分交换功能的物质——细胞外囊泡（EVs）进入人们的视野。

二、干细胞细胞外囊泡（SC-EVs）

（一）EVs的发现

对细胞外囊泡最初的认知起始于上世纪80年代，Trams等的研究发现正常细胞及肿瘤细胞体外培养过程中产生的成分具有5’-核苷酸酶活性，并把这些成分命名为“微泡”（micro-vesicles）[14]。Johnstone等则将体外培养网织红细胞成熟过程中发现的一类具有网织红细胞膜结构和功能特征的小泡命名为外泌体（exosome）[15]。目前认为真核及原核细胞均能产生EVs[2,16-20]，EVs常充当细胞间信号传递和排出代谢废物的途径，同时细胞间亦通过EVs彼此交换成分，这一细胞间信息传递方式贯穿细胞存活全程，与生命活动各方面息息相关[21]。

（二）EVs的成分

EVs是一类包含蛋白、核酸和脂质等多种成分的具有多种功能的物质。人们对EVs的认知有赖于显微镜技术的进步。细胞产生的囊泡成分构成复杂，其构成主要由来源细胞种类及其所处的生理状态决定。一般来说EVs膜富含糖鞘脂、胆固醇及磷脂酰丝氨酸[22]。EVs携带的蛋白种类同来源细胞类似，但存在一定区别。某些蛋白在EVs中的出现频率很高，如HSP70、Alix、某些4次跨膜蛋白（如CD9，CD63，CD81等）以及重要组织相容性抗原II（MHCII）等。EVs携带的核酸成分多样，包括DNA、核糖体RNA、mRNA和非编码RNA，随着学界对基因编辑的持续关注，目前基于EVs核酸成分的研究已成为本领域内的热点[23]。

（三）EVs的分类

E V s依据外形可大致分为三类：（1）直径20～150nm的exosome；（2）直径稍大（50nm～1μm）的微泡（microvesicles），亦称脱落囊泡（shedding vesicles）[24]；（3）直径更大（50nm～5μm）的凋亡小体（apoptotic bodies）[25]。三者统称EVs[19]。上述分类方法中，三类囊泡成分间存在重叠，因此随着对EVs了解的不断深入，开始有学者提出以EVs的来源区分其具体类型，如exosomes特指来源于胞内的一类EVs[26]，而microvesicles则指来源于细胞（特别是损伤细胞和转化细胞）胞膜脱落结构[27]。

三、EVs的应用

（一）疾病诊断的新方法

现认为EVs的成分构成具有细胞特异性，同时也受来源细胞状态的影响，个体在健康与不同疾病状态下产生不同成分的EVs进入循环系统及体液中，因此能够作为评价机体健康或疾病状态的指标，在疾病早期诊断领域具有重要意义[28]。EVs作为疾病诊断工具的天然优势有3点，首先是来源广泛性，目前认为EVs的产生广泛分布于全身各处的组织细胞，这是其反映全身多脏器系统生理病理状态的基础[29]；其次是分泌的连续性，由于EVs的产生是一个连续不断的过程，这样就使得EVs具备全天候反映机体所处的健康或疾病状态的能力[30]；最后是可检测途径的多样性，EVs存在于包括血液、尿液和脑脊液等多种体液成分，这种基于体液中EVs的疾病诊断方法被称为体液活检，能够代替传统活检方式，避免了额外的手术取样步骤、减少了不必要的损伤[31,32]。现已证实多种肿瘤细胞产生的EVs富含miRNAs，可以作为肿瘤早期诊断的特异marker[33]。除了肿瘤诊断外，EVs在非肿瘤疾病的诊断中也有重要作用，目前已得到证实的包括肝脏相关疾病、肾脏疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、神经系统疾病、代谢综合征等均可通过EVs携带的疾病相关因子进行早期检测[29,34-38]。

（二）潜在的疾病治疗作用

过去数年间，随着EVs在多种疾病中的病理生理作用被逐步发现，其在疾病治疗中的可能作用备受关注，现有资料表明EVs本身携带的多种活性分子能够调节靶细胞的基因表达和细胞功能。因此，EVs介导的自分泌、旁分泌、内分泌作用具备作为治疗手段的潜力[39]。已有报道包括间充质干细胞（MSCs）在内的多种干细胞治疗的效果——包括组织保护、内皮生成及损伤修复等——能够通过提取并使用它们产生的EVs成分实现类似的治疗作用[40,41]，近期相关研究也证实了EVs在基因治疗、损伤修复、抗感染、癌症治疗等领域均有积极作用[39,42]。

以MSCs来源的EVs为例，目前已被证实能够促进包括缺氧和高血压损伤在内的多种心血管疾病损伤恢复[43,44]，其在脑损伤中的神经保护作用也得到确认[45]；在小鼠乳腺癌模型中，小鼠MSCs来源的EVs携带的miR-16等效应分子能够通过降低VEGF水平降低肿瘤增殖效率[46]；少突胶质细胞来源的EVs能够促进中枢神经系统髓鞘再生[47]。除上述直接作用外，EVs还能够通过调节免疫和炎症反应水平发挥生物效应，如选取高表达IL-4、IL10和TGF-β的树突状细胞作为来源，其产生的具有免疫抑制作用的EVs能够在多种炎症状态中发挥对病变组织的保护作用[48]。

在ED干细胞治疗领域，相当数量的动物实验和少量人体试验证实局部注射MSCs对包括糖尿病性ED和前列腺癌根治术后神经损伤性ED具有肯定效果[49-52]。近期Albersen等的研究比对了脂肪干细胞（ADSCs）及等量细胞匀浆对神经损伤小鼠的ED治疗效果，两者在改善阴茎勃起功能方面的作用并无统计学差异，表明ADSCs细胞匀浆成分可能具有相应的治疗作用[53]，在这些匀浆中，EVs可能扮演重要的角色，进一步提示SC-EVs具备替代SC发挥疾病治疗作用的潜能。

（三）EVs在ED治疗领域的应用前景

1. 理想的靶向治疗载体：除了包含细胞自然产生并包装的成分，EVs同样可以作为多种药物的理想载体，并用于构建具有治疗效果的效应分子-EVs复合物。EVs的多重特性决定了其潜在的靶向药物载体潜能：脂质包膜结构增强了其在循环中的稳定性，某些蛋白成分也通过抑制补体和吞噬作用降低了EVs的清除率[54,55]，这样就使得EVs适合作为某些低生物利用率药物的载体[56]。另外，EVs能够包装多种物质，这样就使得EVs能够依据搭载物质的不同发挥多种作用[57]。此外已证实局部应用EVs能够显著增加靶细胞部位的EVs浓度，这一作用可能与EVs靶向识别细胞的能力有关，这就使得靶向治疗存在可能[58]。EVs识别靶细胞的机制仍未完全阐明，目前认为EVs对靶细胞的定位可能通过EVs天然携带的表面分子与靶细胞的受体间特异识别实现。由于EVs携带的表面分子与其来源细胞具有同源性，因此当EVs来源细胞同靶细胞之间存在特异性识别关系时，EVs就可能通过特异识别富集到靶细胞上，从而实现靶向定位的效果[59]。

2. 解决海绵体内干细胞（stem cell, SC）注射后高清除率的合理途径：目前最常见的ED细胞治疗方式为海绵体内注射，但由于海绵体本身血供非常丰富，导致局部注射的细胞在极短时间内被清除并随血流分布到全身各部[60]，治疗效率低下。EVs局部注射后能够高效作用于靶点部位这一特点解决了以往ED细胞治疗中的薄弱一环，对EVs-靶细胞特异性结合机制的进一步阐明为构建高效的EVs靶向治疗体系巩固了理论基础。

（四）EVs来源细胞的选择

产生囊泡是细胞的共性，因此能够产生EVs的细胞种类繁多，如何选择恰当的来源不仅关系到对EVs作用机制的探索，更关乎其治疗效果的最优化。一般来说，永生的细胞系产生EVs的效率较普通原代培养细胞高，且细胞的永生化特点使前者更有利于生产大量EVs。然而如前所述，此类永生细胞系产生的EVs存在致癌风险等不确定性。而原代培养细胞来源的EVs其特性更为明确，是相对理想的生物治疗载体。同时，使用自体来源细胞收集的EVs能够显著降低免疫排斥作用。基于以上事实，EVs是理想的生物治疗载体，自体原代培养细胞的EVs收集及利用是有效且合理的选择。

对于ED细胞治疗的理想细胞来源，学界一直在进行探索。2004年Bochinski等第一次证明了胚胎干细胞对神经损伤性ED的治疗作用，研究证实将胚胎神经干细胞注入海绵体神经损伤模型大鼠体内3个月后，相比非治疗组，大鼠勃起功能得到恢复，且一氧化氮合酶阳性神经纤维数量显著上升，提示干细胞治疗有效促进了损伤神经的恢复[61]。此后包括胚胎干细胞（ESCs）、内皮祖细胞（EPSCs）、MSCs、骨骼肌来源干细胞（SKMSCs）、脂肪干细胞（ADSCs）、睾丸基质细胞（HTSCs）和人尿干细胞（USCs）[4,62-67]在内的多种干细胞均被证明对治疗神经损伤性ED有积极的治疗作用。其中ADSCs由于相对容易获取，不涉及胚胎及人体重要器官的损害，因此一直以来都是干细胞治疗ED的研究热点，目前已有许多文献证实了其对神经损伤性ED的积极治疗效果[4]。

MSCs能够分化成脂肪、软骨细胞、成骨细胞和包括星形胶质细胞，少突胶质细胞、小胶质细胞、神经元、神经胶质细胞在内的多种神经样细胞，是外周神经损伤修复的理想干细胞类型。ADSCs是MSCs的一种，因其提取自成体脂肪组织，因此也被称为脂肪来源间充质干细胞（ADMSCs），现已明确与传统的骨髓来源相比，脂肪组织内包含的MSCs密度更大，获取相对容易且对组织损伤更小，因此一直是干细胞治疗领域的研究热点[68]。近年来已有大量研究证实ADSCs在不同神经退变性疾病动物模型具有积极作用[69-71]，且发挥作用的机制以旁分泌效应为主[72-74]。目前认为此类旁分泌效应的发挥主要依赖于ADSCs-EVs实现[75]。由于目前有充分证据表明EVs在神经保护和再生过程中起重要作用[45,47,76,77]，越来越多的学者认为EVs能够实现以往干细胞治疗中的神经修复作用，即EVs能够作为神经退变性疾病的非细胞治疗手段[40, 45, 47, 77]。

四、ED治疗领域EVs的应用前瞻

现已证实SC-EVs具备修复包括内皮、平滑肌及神经等多种组织损伤类型的能力，因此具备治疗器质性ED的潜能[41,78,79]。仅就现有资料来看，EVs已明确的功能包括传递遗传信息、作为载体搭载药物及蛋白、靶向定位特定细胞类型并在生物体内充当稳定的药物治疗载体等。以此为基础，目前SC-EVs在心脑血管疾病防治[43-45,47]、感染性疾病的疫苗研发[80,81]、肿瘤治疗领域[82,83]的研究已取得一定进展，其在多种疾病中的治疗效果亦得到证实。有学者认为EVs领域的未来进展可能集中在两个方向，即：（1）利用并通过生物技术手段增强EVs搭载特定蛋白及RNA的能力、改善EVs对靶细胞的定位及后者对EVs的摄取能力以提升EVs的治疗潜能；（2）构建具有EVs相似特性的脂质体或纳米颗粒，开发新一代替代天然EVs的靶向治疗制剂。笔者认为虽然EVs在多领域研究中的进展令人振奋，但其在ED治疗领域的研究尚未见报道。因此目前对EVs能在多大程度上改善ED症状、通过何种机制或特定成分发挥ED治疗作用以及不同SC来源的EVs在治疗不同类型ED中的具体用量等问题仍待进一步研究。可以预见的是，对EVs的深入研究将进一步阐明其在细胞间信号传导和物质交换的具体机制，从而推动EVs研究从具有前景的现象观察向具备实际效应的成果产出进行转化。

致谢：本文由国家自然科学基金青年科学基金项目（项目批准号：81601272）；北京市自然科学基金项目（资助编号：7174362）课题基金项目资助

勃起功能障碍; 细胞外囊泡

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