外泌体在胶质瘤中的研究进展

李晨龙，王斯文，侯伟良，郑宏山，梁 鹏 （哈尔滨医科大学附属肿瘤医院神经外科，黑龙江哈尔滨150001）

0 引言

胶质瘤来自神经胶质细胞或神经胶质前体细胞，是恶性程度最高的脑肿瘤［1］。根据CBTRUS统计数据显示，胶质瘤的发病率约占中枢神经系统肿瘤的32%，且约占原发恶性肿瘤的80%［2］。胶质母细胞瘤是致死率最高的原发恶性脑肿瘤，其中位生存期约为14.6个月［3］，临床上常用的治疗方案包括手术切除及术后同步的放化疗［4］。因胶质瘤母细胞瘤具有浸润性生长的特点，使其难以全部切除，因此，胶质瘤的治疗成为医学界的一大难点。

肿瘤细胞之间可以通过肿瘤微环境进行通讯，进而影响周边细胞的生物学行为。胶质瘤细胞之间可以利用各种细胞分泌因子，达到细胞间通讯的目的，而包裹这些相关分泌因子的结构被称为细胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）。 EVs是一类无细胞器的细胞基质，封闭在球形脂质双层分子中，并且依据其来源及体积进行分类。来自多泡体（multi-vesicular bodies，MVBs）的囊泡常被称作外泌体，因其直接由细胞质膜生成，又称作细胞微泡［5］。细胞在处于外界压力或死亡状态，以及凋亡小体引起的胞膜空泡化过程中，可以向微环境中排出一些物质［5］。很明显，外泌体作为一种独特的结构参与了一系列重要的生理过程，包括细胞间的蛋白质和RNA交换，诱导血管生成等［6-8］。目前，外泌体在胶质瘤中发挥作用的具体机制尚不清楚。

1 外泌体的生物学特性

1.1 外泌体的构成外泌体的直径为40～120 nm，可以通过100 000 rpm／min离心得到（在蔗糖梯度中浮力密度在 1.13 ～ 1.19 g／mL）［9］。 通过电子显微镜观察显示外泌体为球状的脂质双层结构［10］。其含水内核或脂质膜内部含有多种蛋白质、核酸以及细胞因子，其组成由分泌的细胞来源决定［2，9］。

目前已发现多种外泌体相关蛋白，但其核心组成尚不明确。研究［11］发现，在融合进入细胞与囊泡出芽过程中，脂类在维持细胞膜硬度和稳定性中发挥着重要作用。外泌体含有的脂类成分复杂，据报道［12-13］有多种脂类成分存在于外泌体的脂质双层结构中，包括类固醇、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂GM3和前列腺素等物质。并且，外泌体中还具有多种功能的细胞膜相关蛋白，包括粘附分子和四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81、CD82），ICAM-1和整合素，细胞内运输和细胞膜融合相关（Rab蛋白，钙磷脂结合蛋白），MVB形成相关蛋白（Alix， TSG101）［14］，其他可能存在的蛋白主要由细胞类型以及分离的方式决定。

1.2 外泌体与胶质瘤相关性胶质母细胞瘤患者术后出现肿瘤复发，主要与肿瘤侵袭性生长的特性有关，有研究［15-17］显示一些具有高侵袭性和转移性的肿瘤细胞具有形成侵袭性伪足的特征。而由细胞粘附因子、细胞内信号途径、配体以及肌动蛋白调节蛋白构成了复杂的网络，共同发挥水解侵袭性伪足的功能［18］。 有研究［19］发现外泌体可以和侵袭性伪足发挥协作关系，改变或者降解周围的细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭。并且，外泌体可以通过改变周围支持细胞的生物学表型，促进肿瘤细胞增殖和侵袭的微环境。而在细胞中加入间质细胞来源的外泌体，进行共培养后，发现其具有促进肿瘤细胞增殖的能力，研究［20］发现其不仅可以影响脑部正常的支持细胞（星形胶质细胞），还可以使胶质母细胞瘤的其他亚型发生表型的改变。因此，细胞间的外泌体转运机制可以作为研究胶质母细胞瘤生物起源和细胞发展的潜在作用因素。

外泌体是肿瘤细胞分泌的代谢产物、生长因子、离子和细胞因子等复杂物质的延伸［16］。既往研究［15-17，21］已确定外泌体可以介导组蛋白、致癌因子（EGFRvIII）、miRNA 以及肿瘤抑制因子（PTEN）在胶质瘤中的转运。胶质瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤微环境的形成，包括功能性RNA的转录、血管生成、克隆形成能力，以及旁分泌途径诱导的增殖能力增强、免疫耐受能力或诱导正常细胞的恶性转变的过程有关［22-25］。并且，胶质瘤来源的外泌体可以改变细胞表面蛋白的表达和细胞因子的分泌，并同时可以通过改变免疫细胞的吞噬能力影响肿瘤微环境中的免疫功能［20，26］。

2 基于外泌体的诊断

2.1 胶质瘤分泌外泌体的可检测性胶质瘤的异质性特征使得患者的生存期各不相同，因此，需要更多的可以监控疾病进展和治疗反应的方法。而检测外泌体中含有的功能性分子标志物具有一定意义，通过收集含有患者外泌体的液体活检标本，以微创的方式监控疾病的进展，可以使胶质瘤患者诊断和个性化治疗方案发生深刻的变革［27］。在胶质瘤的诊断中，结合外泌体中标志物的检测方法可以补充现有的组织活检病理学和MRI诊断方式的不足，有助于对患者的肿瘤进展进行监控。并且液体活检外泌体中分子标志物的方法具有创伤小、可靠性强的特点。通过分离肿瘤细胞分泌的外泌体并进行富集，与健康人群循环系统中外泌体中所含有的分子进行比较，得到差异表达分子［28］。

目前已经可以从胶质瘤患者血液样本和脑脊液中分离外泌体，其中包含脑肿瘤细胞来源的蛋白、脂类、RNA和DNA。提示基于胶质瘤来源的外泌体是可以离开脑实质并进入外周循环［9］。随后通过使用多种方法分离外泌体，包括超速离心及过滤法，或抗体聚集法，将外泌体从患者的体液样本中分离出来。而相对于既往肿瘤活检或切除这种高度侵袭性的取材方式，生物体液样本的外泌体分离可以在患者的整个治疗过程中多次进行［29］，更具有肿瘤进展检测的意义。

2.2 胶质瘤分泌外泌体的肿瘤特异性肿瘤细胞分泌的外泌体中富含肿瘤特异性分子，相比肿瘤细胞内含量高出近百倍。而脑脊液是外泌体研究中最具有吸引力的，因为脑脊液避开了血脑屏障对胞外囊泡浓度的限制，可以轻松穿越进入外周循环。脑脊液相对于血液循环来源非肿瘤细胞的外泌体或血小板来源的微粒相比，具有“杂质”少的特点［30］。

目前已有一些细胞核外RNA被确认为胶质瘤特异性生物标志物，包括突变型EGFRvIII、IDH1和miR-21［31］。收集胶质瘤患者脑脊液中外泌体后发现，细胞核外野生型EGFR表达水平与化疗反应存在相关性，并且可以作为胶质瘤患者药物敏感性的潜在生物标志物，如高达70%的胶质母细胞瘤患者中存在EGFR 过表达［32-33］。 并且，研究［34］显示 EGFRvIII 的表达与胶质母细胞瘤的传统分子亚型存在相关性，通过检测外泌体EGFRvIII的表达水平，可以为患者制定个体化治疗［35］。通过使用免疫磁性外泌体（iMER）技术检测标志物EPHA2，可使胶质瘤组织的识别率达84.4%，检测EGFR可达78.1%，而通过联合检测这两种标志物，可使胶质瘤组织的总体检测正确率达到90%［36］。研究已知 miR-21可以调节 EGFR的表达，并且已在100%的胶质瘤患者的脑脊液中检测到，提示miR-21为检测胶质瘤的一种高度敏感的标志物，并且实验证实与肿瘤转移的微环境的调控有关［37］。由于IDH1突变与原神经分子亚型相关，已有研究证实其突变与良好的临床预后相关［36，38］。

2.3 外泌体作为化疗耐药标志物的研究外泌体可以作为肿瘤化疗的敏感性依据，甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）在替莫唑胺治疗胶质瘤过程中可以发挥修复损伤的DNA双链的作用。在胶质瘤患者中，MGMT启动子DNA甲基化上调可以减少细胞中特定核蛋白的表达，通过对患者的血清进行iMER检测发现，对于耐药人群，在接受莫唑胺治疗后，其外泌体mRNA表达水平升高［38］。此外，miR-603和miR-181d的表达水平改变同样与MGMT表达水平相关［39］。由于外泌体MGMT的mRNA水平是可进行检测的，因此可在治疗期间对患者的化疗反应进行监测。

3 基于外泌体的治疗

3.1 抑制外泌体生成、吸收和分泌已有证据显示外泌体在胶质瘤的生物进程中发挥了重要作用，靶向外泌体介导的细胞间相互作用的治疗成为了一个新的治疗领域。通过使用外泌体生成抑制剂可以影响细胞的炎症反应，减轻细胞内的囊泡形成［40］。Rab GTP酶被公认为人类疾病的重要靶点，其自身发生突变或者表达下调均可引起一系列疾病的发生［41］。借助于外泌体调节细胞膜的物质交换，Rab GTP酶在细胞信号传递和外部刺激的反应中发挥重要作用。而抑制Rab27a的表达可以在体内和体外实验中减少癌症促进性外泌体的释放，抑制原位肿瘤的生长和远处转移［42］。

3.2 外泌体药物靶向投递系统由于外泌体具有较长的循环半衰期，内在的靶向受体肿瘤细胞能力，生物相容性和低毒性等良好特性，因此可以构建成为理想的药物投递系统［43］。最近，来自于内皮细胞的外泌体被应用于投递紫杉醇和阿霉素跨越血脑屏障进入脑部发挥作用，抑制了肿瘤的生长［44］，显示了外泌体治疗的优势。在小鼠模型中发现，通过工程改造来自树突状细胞，表达一定数目膜蛋白的外泌体，成功地穿越血脑屏障进行siRNA投递。

3.3 外泌体与 miRNAGallo 等［45］通过检测全血、尿液、唾液、脑脊液和外泌体中的miRNA水平后，发现绝大多数细胞外miRNA实际上存在于外泌体中。外泌体包裹RNA后可以保护其免受细胞外RNA酶的降解，而外泌体则扮演了细胞间miRNA搬运工的角色，从而调节细胞内mRNA的翻译［46］。目前尚无法确认所有的外泌体中均含有RNA，但是一些研究显示肿瘤来源的外泌体可能还由与亲代细胞不同的RNA组成［47-59］。并且，外泌体释放进入细胞外环境时，其中含有的RNA的选择和包装的机制目前尚未研究清楚［51］。

4 展望

目前已知外泌体和其他细胞外囊泡可以通过传递多种分子和物质用于供体和受体细胞之间的远距离通讯。并且越来越多的研究显示外泌体可以参与多种肿瘤的生物学过程，而肿瘤细胞分泌的外泌体不仅存在于肿瘤的进展过程，也同样应用于周边微环境的修饰，最终积极地改变了肿瘤的微环境，使肿瘤细胞存活下来。目前对于胶质瘤外泌体研究领域，还需进行更多深入的研究：包括优化分离技术、胶质瘤相关外泌体的特征研究和外泌体标志物的检测方法，最终可以使外泌体的投递成为诊断、预后和靶向治疗的潜在作用靶点，减少胶质瘤治疗时的脱靶效应，提高患者生存期，从而有望成为临床治疗胶质瘤的一个突破点。