脑胶质瘤干细胞分选方法研究进展

庞 龙，张军峰，刘博迪，郝宏博，徐 曦

（1西安医学院基础医学部，陕西西安710021；2西安交通大学能动学院，陕西西安710049）

0 引言

脑胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）是指存在于脑胶质瘤中具有独立成瘤能力的一种细胞［1-3］。相较于其他的肿瘤细胞，GSCs具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能、耐药性等特征［4-5］。研究［6-7］表明GSCs是脑胶质瘤发生的“始动”细胞，在脑胶质瘤的发生、发展、维持、转移扩散和复发过程中起着关键性作用。但是GSCs在整个脑胶质瘤细胞中的含量极其微小，这给它的研究带来了很大的困难［8］。目前根据分选是否需要细胞表面标记物，GSCs的分选主要可以分为细胞表面标志物分选和不依赖细胞表面标记物分选法两种方式［8-9］，利用细胞表面标志物分选的特点是分离得到的GSCs纯度高，但缺点是该方法破坏了细胞的生物化学性质不利于后续的检验研究。此外，该方法必须依赖已知的标记物，而对于未知的标记物则无法进行检验［10］。随着微流控芯片技术的发展，不依赖细胞表面标记物分选法得到了长足的发展。本文将结合GSCs的生物学特性对目前GSCs分选的常用方法和技术展开探讨。

1 GSCs的生物学特性

作为肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSCs）的一种，GSCs拥有与肿瘤干细胞相同的生物学特性，而这些特征也是GSCs分选的依据。所谓TSCs是指存在于肿瘤细胞中的一小部分细胞，这些细胞具有自我更新、无限增殖能力以及多向分化潜能的干细胞样特性，它们是肿瘤发生、转移以及复发的根源［11-12］。TSCs的概念提出于20世纪60年代，但当时缺乏先进的分子生物学与细胞生物学实验技术，直到21世纪初美国癌症研究学会（American Association for Cancer Research，AACR）才正式宣布承认TSCs。这标志着TSCs得到了医学界的公认，从而使TSCs的研究进入了一个新的阶段。TSCs理论为我们重新认识肿瘤的起源、肿瘤的诊断与治疗等方面提供了新方向［13］。TSCs的主要特征包括类干细胞特性、悬浮球状生长、无限增殖能力、致瘤能力等。

1.1 类干细胞特性从某种意义上，干细胞与TSCs具有相似性［14-16］。在最初研究TSCs时发现它和干细胞表达相同的基因与标记物如SOX2、CD133、Nestin等［17-18］，这些标记物通常作为TSCs鉴定的主要依据之一［19-20］；研究［21-22］发现 TSCs 和干细胞共用一些与细胞代谢、自我更新相关的信号通路，如Notch和 Wnt／β-catenin；此外，TSCs和干细胞都具有自我更新能力、增殖能力及多向分化潜能，并且两者的增殖方式都为不对称分裂（asymmetrical division）。

1.2 悬浮生长与无限增殖能力研究［23-24］发现使用神经干细胞的无血清培养液培养胶质瘤干细胞时会出现肿瘤球。连续传代后的肿瘤球生长速度加快，且能够保持稳定的聚集状态。此外，研究［25-26］还发现由亲本脑胶质肿瘤干细胞球制成的单细胞悬液能够再次培养形成肿瘤球，且该肿瘤球保持与亲本肿瘤球一致的表型。GSCs具有无限增殖能力，这表现为在肿瘤组织中绝大多数的肿瘤细胞增殖能力有限，只有含量很少的GSCs才能够形成新的肿瘤细胞群并转移和扩散［27］。胶质瘤干细胞可以实现自我更新，形成与父代相同表型的子代TSCs，与此同时胶质瘤干细胞可以分裂增殖成肿瘤组织中大量含有的其他肿瘤细胞。

1.3 致瘤能力GSCs最大的特征是其致瘤能力。不同于肿瘤组织中其他的肿瘤细胞，含量稀少的TSCs具有很强的致瘤能力［28］。人源性肿瘤细胞的致瘤能力通常通过体外克隆形成和免疫缺陷小鼠体内的肿瘤形成能力两个方面进行评价。其中体外克隆形成是将源自原发性肿瘤组织或细胞系的TSCs在软琼脂或基底膜类似物上进行培养，比较它们可形成的克隆数目及所形成的肿瘤球大小；免疫缺陷动物体内的肿瘤形成能力是指将分选的相同数量的TSCs和非TSCs分别按相同方式接种于免疫缺陷小鼠体内，观察它们在相同时间内的肿瘤形成情况。研究［19］表明，TSCs（CD133+）体外克隆明显大于CD133-的脑肿瘤非干细胞。同时对比接种后24周内形成可以连续移植的肿瘤，使用非糖尿病型严重联合免疫缺陷小鼠（non-obese diabetic， severe combined immunodeficient，NOD-SCID），接种105个CD133-的脑肿瘤非干细胞的NOD-SCID未见肿瘤形成，而使用100个脑TSCs接种则可以形成肿瘤［5］。脑胶质瘤的发生、发展、维持、转移、复发等均与 GSCs有着密切的关系［29］，可以说GSCs是导致脑胶质的罪魁祸首！

2 GSCs常用的分选方法

由于GSCs在整个脑胶质瘤中含量非常稀少，使它的分离非常困难。因此，GSCs的分选是进一步研究胶质瘤干细胞的难点和基础。按是否使用细胞表面标记物可分为细胞表面标志物分选和不依赖细胞表面标记物分选法两种方式。下面将这两种方法进行概述。

2.1 细胞表面标志物分选作为胶质瘤细胞中含量较少的一个亚群，对于GSCs特异性标记物的研究一直是热点内容。目前已经证实的GSCs标记主要包括：位于细胞核中的 SOX2、Olig2、BMI-1、EZH2，位于细胞质中的 Nestin、BMX以及细胞膜表面标记物CD133、CD15、CD90、Integrin-α6、L1CAM 等［29］。 其中，细胞表面标记物对特定细胞分选是目前进行细胞分选研究最为常用的方法。这种方法是借助于已知的特殊细胞表面标志物，利用免疫磁珠或将可与特殊表面标记物结合的带荧光的“标签”对GSCs进行标记并分选［30-32］。通常采用的方法包括免疫磁珠分选法（magnetic activated cell sorting， MACS）、荧光激活细胞分选法（fluorescence-activated cell sorting，FACS）等。

MACS进行GSCs分选主要是将GSCs表面的特异性抗原标记到免疫磁珠表面［33］，将标记过的磁珠与单细胞悬液共同孵育，使磁珠结合到GSCs表面，然后在磁场的作用下将GSCs分离出来。此外，还有一种方法是先用特殊的一抗与胶质瘤干细胞结合，再用标记有二抗的磁珠与之结合，通过使用易降解材料制作磁珠可以降低对目标细胞的损伤。

与MACS相同，FACS也是常用的一种分选方法［34-37］。FACS具体是利用细胞表面的特异性抗原，通过将带荧光标记的特异抗体与TSCs表面特殊抗原结合，将细胞分为带荧光标记的目标群和不带荧光标记的细胞群，然后借助于流式细胞仪将目标细胞进行分离。由于使用了流式细胞仪，该方法又被称为流式分选法。

采用细胞表面标志物分选的优点是可以利用已知的确定性标记物得到纯度高的胶质瘤干细胞，给后续的胶质瘤干细胞研究提供了良好的基础［38-39］。缺点是该方法需要复杂的操作和昂贵的设备支持，如使用MACS需要制备特殊的磁珠，而使用FACS则需要使用流式细胞仪［40］。而且分离的通量受到设备和操作参数的影响，如FACS需要使用合适的电压进行，在需要提高操作通量增加电压时又会影响到目标细胞的活性。此外这些操作必须保证均在无菌环境下进行。

除去以上两种方法外，还可利用启动子驱动的荧光蛋白表达特性进行GSCs的分选。启动子驱动荧光蛋白表达特性是通过控制GSCs特异性标志蛋白的基因启动子构建慢病毒载体，并用这些慢病毒载体去感染胶质瘤细胞，通过与药物共培养筛选或流式分选等方法进行分离，分离得到的细胞可以进一步培养［41］。该方法对于完善和证明相关标记物与GSCs之间的关系以及靶点药物的研制有重要的意义。此外，罗丹明123（Rhodamine 123， Rho123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位指示剂。研究［42］表明TSCs区别于其它细胞，可以通过细胞表面的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）将线粒体染色剂Rho123主动外泵至胞外，利用Rho123结合流式细胞分选术富集干细胞的方法将低荧光亚群分选即可达到富集和分离TSCs的目的。

2.2 不依赖细胞表面标记物分选法

2.2.1 侧群细胞（side population， SP）分析法 SP 分析法是一种不依赖于细胞表面标记物的分选方法［43］。其原理主要是利用GSCs高表达细胞膜ABCG2转运蛋白［44-45］，这种蛋白可以将细胞核染料Hoechst33342转移到细胞外。这种特性使GSCs区别于其他胶质瘤细胞，具有Hoechst33342细胞核染料拒染性，可以利用这一特征采用流式细胞术将GSCs从胶质瘤细胞中分离出来。

2.2.2 无血清培养法 无血清培养法是利用神经干细胞培养液培养胶质瘤细胞，神经干细胞培养液中不含血清，这可以阻止其中绝大多数非胶质瘤干细胞的增殖［46］。但这种培养液中添加有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，可以促进胶质瘤TSCs的增殖。在这种细胞培养液中，GSCs可以形成致密的肿瘤球并悬浮在细胞培养液中；而非TSCs则贴壁生长。可通过多次收集悬浮肿瘤球进行克隆培养得到次代纯度高的 GSCs［47］。

2.2.3 利用耐药性进行分选 胶质瘤的耐药机制是目前已知胶质瘤患者化疗失败的主要原因之一，而GSCs起到了关键作用［48-49］。这是因为GSCs通常高表达ATP结合盒（ATP-binding casette，ABC）转运蛋白，如 ABCG2、ABCG1、P-糖蛋白等［50］。 这些蛋白可以将抗癌药物“泵出”到细胞外，从而形成对抗癌药物的耐药性特征［51］。 Wang 等［52］利用无血清悬浮培养联合低浓度长春新碱富集分离GSCs。其中长春新碱是一种细胞周期特异性药物，可诱导除GSCs外的绝大多数胶质瘤细胞凋亡或死亡，而具有耐药性的GSCs得以保留并继续增殖。结果表明相较以前单独使用无血清培养液纯化GSCs，这种方法可以缩短传代次数，提高GSCs的纯度。

3 基于微流控芯片技术的分选方法

除了上述常用的TSCs分选方法外，近年来随着微流控芯片技术的发展，使TSCs分选方面有了更为多样的选择。相对于传统的方法，微流控芯片技术可以将很多反应单元集成到一块只有几厘米大小的芯片上进行，这使得微流控芯片具有低成本、操作简单、高度集成的特点［53-54］。目前其在生物学领域特别是细胞分选方面有着广泛的应用。按传统的分类方法可以将基于微流控芯片技术的细胞分选方法分为细胞表面标志物分选和不依赖细胞表面标记物分选法两种方式。

3.1 细胞表面标志物分选与传统的分选方法相同，基于微流控芯片分选方法的基本分选原理不变，但利用微流控芯片技术可以大大降低研究成本，并减少操作步骤，提高分选效率和通量［55-56］。使用微流控芯片进行细胞分选主要是利用特异性的标记物通过充分接触或者流体操作的原理进行分选［57-58］。目前利用细胞表面标记物特异性地针对GSCs分选的微流控芯片还未出现，但是捕获源于脑胶质瘤的循环肿瘤细胞技术已经出现。由于源于脑胶质瘤的循环肿瘤细胞与GSCs存在着密切的关系，因此源于脑胶质瘤的循环肿瘤细胞分选技术可以给GSCs分选提供借鉴和参考。

在脑胶质瘤细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是最常被过度表达的受体酪氨酸激酶癌基因。EGFR与肿瘤细胞的迁移、粘附、侵袭的信号转导等相关，并与细胞增殖、血管生成和抗凋亡机制有密切关系［59］。 Wan 等［60］设计了专门与脑胶质瘤细胞表面EGFR特异性结合的适配子，并将其预先孵育到微管道中。适配子技术是利用人工合成的单链寡核苷酸（DNA或RNA），或者肽链与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力、高特异性的结合。借助于微流控流体操作技术可以将目标细胞捕获到芯片中，而其他正常的细胞则被去除。Sullivan等［61］利用抗体鸡尾酒法将 SOX2、Tubulin beta-3、EGFR、A2B5和c-MET的抗体孵育到CTC-iChip的流体管道表面，利用微流控流体操控技术使细胞样品与管道表面充分的结合，从而使目标细胞被分离出来。

3.2 不依赖细胞表面标记物分选法利用不依赖细胞表面标记物分选法可以克服细胞表面标记物法破坏所分选细胞的生物化学性质的缺点。此外，该方法还可以对于某些未知的标记进行筛选和确认。随着对TSCs研究的深入，越来越多的研究证据表明TSCs的生物机械性能与其生物学特征密切相关［62-63］。肿瘤通过外周血循环发生转移时，TSCs需要穿过血管内皮细胞层到达血液中，此时细胞大小、变形性起到了关键作用［64-65］。此外，当TSCs移动到次生肿瘤发生部位时，通常要与血管内皮细胞发生粘附作用，此时TSCs粘附血管内皮细胞的能力起到了关键作用［66-67］。因此，利用TSCs的生物机械性能对其进行分选，不但能够最大限度地保留所分离细胞的生物化学性质，而且能够为发现新的TSCs标记物提供条件［68-69］。利用传统的研究方法实现对TSCs生物机械性能的研究比较复杂且困难，而微流控芯片技术的发展则为TSCs生物机械性能的研究提供了更为方便的工具。

Zhang等［70］利用微流控芯片微柱阵列将肿瘤细胞按变形性分为变形性强亚群和变形性弱亚群。通过比较两个亚群细胞的TSCs特征基因表达检测、成瘤能力分析、流式细胞术TSCs含量检测发现，变形性强的细胞亚群中TSCs的含量要远远高于变形性弱的亚群。随后该小组又设计了一种利用细胞粘附力进行肿瘤细胞分选的微流控芯片，研究表明在特定条件下，粘附力与TSCs含量成反比，粘附力弱的细胞亚群TSCs的含量高［68］。通过微流控芯片分选不同大小的人间充质干细胞时，小的干细胞比大的干细胞更易诱导成为其他的终末细胞，该发现首次将干细胞的大小与干细胞的生物学性质联系了起来［71-72］。基于以上研究背景，Pang等［73］设计并制备了一种能够将不同大小和变形性单细胞阵列化的微流控芯片。以人多形性脑胶质瘤细胞系U-251为模板，研究发现脑胶质瘤细胞的生物机械性能与其耐药性密切相关，即小而／或变形性大的肿瘤细胞的耐药性比大而／或变形性差的肿瘤细胞要强。这提示是否GSCs与生物机械性能也存在着密切的联系？当然这有待于进一步的研究证明。

4 结论与展望

GSCs在脑肿瘤发生、发展和转移中起着关键作用。而GSCs分选依然是TSCs研究的关键性技术瓶颈问题。传统的方法多基于GSCs表面特异性标记物对TSCs进行分选研究。随着对GSCs研究的进一步深入和微流控芯片细胞分选技术的发展，基于GSCs侵袭特性、细胞分裂次数异质性、大小和变形性等非标记物分选 GSCs将得到长足的发展。未来GSCs的分选研究主要面向两个方面：①临床的检测，这就要求检测的操作更为简单，成本更为低廉，检测的过程更为高效，该过程只需要针对目前已知的标记物进行检测；②科学研究，该过程对GSCs分选的研究主要集中在分选后提过的后续理论研究与药物筛选，因此需要将分选与后续的检验结合起来使GSCs的研究更为便利和丰富，为脑胶质瘤临床治疗提供新的理论基础。