环状RNA在胶质瘤中的研究进展

朱 磊，董 伦，张恒柱 （大连医科大学，辽宁 大连 6044；江苏省苏北人民医院神经外科，江苏 扬州 500）

0 引言

胶质瘤约占原发性中枢神经系统肿瘤的40%～60%［1］，是中枢神经系统最常见的肿瘤，世界卫生组织（WHO）根据肿瘤的细胞和组织学特点，将其分为Ⅰ～Ⅳ级。胶质瘤可发生于中枢神经系统的任何部位和任何年龄，平均存活期仅为14个月［1］，其中胶质母细胞瘤恶性程度最高，预后最差，95%未经治疗的患者生存期不超过3个月。胶质瘤的发生发展涉及细胞周期与信号传导通路、基因表达等多方面内容的改变。因此，研究胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤的相关分子机制，探索新的、安全有效的诊疗方法具有重要意义。

环状RNA（circRNA）是近年来发现的一种特殊类型的RNA，是指3′端与5′端共价结合形成的闭合单链环状RNA，由Sanger等［2］于1976年在类病毒研究中发现，并首次提出此概念。由于早期普遍认为circRNA是基因表达中的副产物，因此关于环状RNA的研究也停滞不前。近年来，随着分子生物学及分子测序技术的迅猛发展，环状RNA的潜在特性和功能逐渐被发现。有研究［3］指出，环状RNA在神经系统中含量丰富，呈现动态表达的特点，而且可能参与了胶质瘤的增殖、转移等多个生物学过程［4］，有望成为胶质瘤的新型诊断标志物，并为治疗提供新的思路和方向。本文主要介绍环状RNA的形成、特点及功能，并讨论在胶质瘤中的作用。

1 环状RNA的产生、特点和功能

1.1 环状RNA的产生环状RNA的具体产生机制尚未明确，根据前体序列的来源可分为外显子形成的环状 RNA［4］、内含子形成的环状 RNA［5］、外显子和内含子共同组成的环状 RNA［6］及 tRNA前体形成的环状RNA［7］。 ①外显子来源的环状 RNA（exo circRNA），其形成主要有直接反式剪接（或称内含子配对驱动环化）和外显子跳读（套锁驱动环化）两种机制，过程复杂，需ALU重复序列等多种因子参与。前者是一个外显子的3′端剪接供体与上游的5′端剪接受体结合，切除内含子，然后形成环状 RNA［4］；后者是内含子之间配对形成环状套锁，再剪切其中的内含子，最后形成环状RNA［8］。②内含子来源的环状RNA（ciRNA），形成依赖于外源性鸟苷（exoG）、5′端剪接区域7 nt长的富含GU的序列及靠近分支部位的11 nt的富含C的序列，此类环状RNA较为少见，但具有转录调节的作用［5］。③外显子和内含子共同组成的环状RNA（EIciRNAs），通过直接反向剪接形成，内含子不被剪切，保留其中。这类EIciRNAs只存在于细胞核中，能够促进亲本基因的转录［6］。④tRNA前体形成的环状 RNA（tricRNA），如tric31905，其形成需要保守的tRNA及加工酶的参与，但具体的机制及功能尚未明确［7］。

1.2 环状RNA的特点①分布广泛，含量丰富。据报道，环状RNA广泛分布在原核和真核细胞中，从病毒、果蝇到人类细胞都有环状RNA的存在［3］；10%以上人类基因可以转录生成环状 RNA［9］，You 等［10］指出，脑组织中约20%的编码蛋白的基因可以产生环状RNA。②结构稳定，半衰期长。环状RNA无5′帽结构和3′-PolyA尾结构，对RNA核酸外切酶和脱支酶有一定抵抗性［11］，大多数环状 RNA半衰期超过48 h［12］，比线性 RNA 半衰期（约 10 h）长［13］，然而环状RNA核酸内切酶可使内含子来源的环状RNA水解，其半衰期（小于 15 s）较短［14］。 ③高度保守，表达特异。共价闭合环状结构使环状RNA稳定性好，导致保守性高，而且序列长度在进化中也高度保守［3］；You等［10］指出环状RNA首尾相接处的外显子更具有高度的保守性。环状RNA的表达具有时间和空间特异性，Rybak-Wolf等［3］在实验中证实，相对其他组织，环状 RNA（如 circRims2、circTulp4、circPhf21a等）不仅在人和鼠等哺乳类动物脑组织中表达丰富，甚至在果蝇中也是这样。另外，环状RNA表达具有组织特性，其中嗅球、前额叶皮质、海马、小脑等高表达特定种类的环状RNA；在神经元的不同部位，环状RNA的含量也不相同，突触中的丰富度最高，这可能与皮质中突触密度高、ALU重复序列多等有关。环状RNA表达也具有分化发育阶段的特异性，其增多通常伴随着宿主转录的上调，当然也有例外，比如环状RNAZfp609（circZfp609）在神经元分化过程中持续定量表达，这提示环状RNA在脑组织分化发育中可能具有重要作用。除此之外，环状RNA在肺、胰腺、膀胱、胃、直肠等组织中均有表达，而且可以随着组织器官的发育而表达，如心脏中的NCXI就随着发育的不同阶段被诱导表达［15］。

1.3 环状RNA的功能（1）海绵作用。①miRNA的海绵作用［16］。miRNA是一类长度约21 nt，与mRNA靶向结合的 RNA［17］。环状 RNA具有与 miRNA结合位点，起到抑制其对应miRNA的降解作用。如小脑退化相关蛋白1反义转录物（CDR1as／ciRS-7）在小脑中表达丰富，具有miR-7的应答元件，通过海绵作用减弱miR-7的生物学功能［18］。在星形细胞瘤中miR-7表达下调，使得胶质瘤迅速生长，但并非miR-7越高对肿瘤抑制性越强，有报道称肺癌的不良预后就与miR-7的高表达有关［19］。②蛋白质的海绵作用。这种环状RNA被称为蛋白质海绵，如CDR1as／ciRS-7可与 AGO蛋白（Argonaute）结合，从而使自身被降解［20］。（2）转录调节。 如前所述，环状 RNA具有转录调节作用。ciRNA中如锚蛋白重复域 52（ciankrd52）可与RNA聚合酶Ⅱ复合体相互作用，参与转录调节［21］。（3）翻译作用。众所周知，大多数环状RNA属于非编码RNA，但仍有例外。如丁型肝炎病毒（HDV）的核心是一单股负链的circRNA，其可以转录翻译成丁型肝炎核心抗原。（4）其他作用。Talhouarne等［22］发现ciRNA在细胞分裂过程中可遗传给子代细胞，提示具有遗传上的作用。由于稳定性好，环状RNA可能存在其他生物学功能，比如作为组装核糖体蛋白（RNP）颗粒的平台，转运其他蛋白质或其他RNAs的良好介质，这也为新型肿瘤药物的研发提供了新视角。

2 环状RNA与肿瘤

近年来，环状RNA在肿瘤方面的研究已经取得了一定的成果。如Huang等［23］对结肠癌的分析表明，cir-ITCH在结肠癌中表达明显下降，通过海绵作用与亲本的 ITCH基因竞争 miR-7和 miR-20，抑制Wnt／β-catenin 信号 传 导通路；Li等［24］发现 circRNA002059在胃癌中表达下降，与胃癌的恶性程度、转移等相关；Huang等［25］发现circRNA MYLK可以竞争性结合 miRNA-29a-3p，导致膀胱癌的发生；Xuan等［26］研究指出，has-circ-100855在喉癌上调明显，而has-circ-104912在喉癌中却下调明显等，诸多研究均提示环状RNA在肿瘤发生发展中扮演着重要角色。

3 环状RNA与胶质瘤

3.1 环状RNA与胶质瘤的研究逐步兴起Song等［27］研发了一种UROBORUS新型检测工具，他们利用46个胶质瘤（包括少突胶质细胞瘤和GBM）和正常脑组织样本作研究，发现所有样本中高表达的环状RNA的外显子数量没有显著的差异，大约10%的环状RNA只含有一个外显子；而且大多数环状RNA反向剪接点的基因长度在50 kb内，只有少数在100～300 kb之间。此外，研究还发现RIMS基因在正常脑组织会产生5种环状RNA异构体，而在胶质瘤中只有2种，这提示胶质瘤会减少RIMS基因形成环状RNA异构体的数量。然而，并非所有基因都是如此，VCAN在正常脑组织和胶质瘤组织中形成环状RNA异构体数量没有差别，但circ_VCAN的表达在胶质瘤中却比正常脑组织高，而且有实验［27-28］证实VCAN基因是形成胶质瘤的责任基因。GBM中表达的circ_COL1A2、circ_PTN、circ_VCAN、circ_SMO、circ_PLOD2、circ_GLIS3、circ_EPHB4、circ_CLIP2 较正常脑组织高，提示此8种环状RNA有可能成为GBM的肿瘤标志物。

3.2 多形性胶质母细胞瘤 （glioblastoma multiforme， GBM）GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VSNL1轴的表达失调［29］。 小脑退化相关蛋白1 反义转录物（CDR1-AS）是 2011 年由 Hasen 等［30］发现的一类环状RNA，具有miR-671-5p的结合靶点，在GBM细胞中表达下调。Barbagallo等［29］研究了45位GBM患者的活检组织和5个 GBM（分别是A172，CAS-1、DBTRG、SNB-19、U-87）细胞株，发现 miR-671-5p在GBM活检组织和细胞株中均过度表达，其中miR-671-5p在A172、CAS-1、DBTRG细胞株中的表达超过其他肿瘤细胞株（A375，HCT116）的两倍。且发现 CDR1-AS、CDR1、视锥蛋白样因子 1（VSNL1）作为miR-671-5p的下游分子，在GBM细胞中表达减少，与miR-671-5p表达呈负相关，其中 CDR1-AS表达下调了 3.51 倍，CDR1 下调了 2.84 倍，VASNL1 下调了 2.1倍，而且发现miR-671-5p能促进GBM细胞的转移和增殖。转染miR-671-5p的类似物24 h后，发现DBTRG、SNB-19、U-87细胞株中GBM细胞的转移能力分别增加了15%、32%、15%。DBTRG细胞株转染miR-671-5p类似物24 h后生存能力增加了16%，而使用抑制物72 h后则使其生存能力下降了12%；同样，SNB-19细胞株转染类似物48 h后，其生存力增加了9%，转染抑制物72 h后，下降了7%；U-87细胞株转染miR-671-5p类似物后，生存能力增加了5%，而转染抑制剂48 h后，生存能力会下降19%；故此推测GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VASNL1 轴的表达失调。

3.3 胶质瘤涉及 circ-TTBK2／miR-217／HNF1β／Derlin-1轴的表达失调TTBK2环状RNA（circ-TTBK2，根据环状 RNA数据库也称 circ-0000594），由TTBK2基因的外显子 3、4、5、6产生，不含内含子，定位于胞浆中，Zheng等［29］发现与正常脑组织相比，circ-TTBK2在胶质瘤中明显表达上调，能抑制肿瘤细胞的凋亡，而且和胶质瘤的病理分级呈正相关。此外，利用正常星形胶质细胞作对比，发现miR-217在胶质瘤U87和U251细胞株表达下调，而且使miR-217恢复正常表达能起到抑制胶质瘤细胞增殖的作用，因此推测miR-217在胶质瘤中发挥了肿瘤抑制作用。进一步指出circ-TTBK2以RNA诱导的沉默复合体（RISC）的方式减少miR-217在胶质瘤细胞的表达。肝细胞核因子1β（HNF1β）定位在胞核，它不仅是肝脏特殊转录因子，而且在胶质瘤细胞中表达上调。在细胞株中加入 circ-TTBK2抑制子和／或使miR-217过表达，HNF1β表达量均明显减少，为了更深入了解 miR-217与 HNF1β的关系，将 HNF1β的3′-UTR 和非HNF1β 3′-UTR 作比较，结果是胶质瘤细胞在 miR-217+HNF1β 3′-UTR 组比 miR-217+HNF1β的迁移性和侵袭性要高，这表明miR-217是通过和HNF1β 3′-UTR相互作用调节信号传导通路的。HNF1β作为Derlin-1的启动子促进Derlin-1的表达，而Derlin-1则是通过激活PI3K／AKT／ERK发挥致癌因子的作用，促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制细胞的凋亡。和circ-TTBK2相似，HNF1β也与胶质瘤的病理分级呈正相关。

3.4 沉默 cZNF292 能通过 Wnt／β-catenin 信号传导通路抑制胶质瘤血管生成和细胞增殖cZNF292是一种致癌性的环状RNA，通过作用于Wnt／β-catenin通路即 Axin／β-catenin／APC／STAT3／5 通路在肿瘤的血管生成和细胞增殖方面扮演了重要角色。Yang等［30］在体外U87MG和U251胶质瘤细胞株中，沉默cZNF292的表达，发现血管内皮生长因子A（VEGF-A）及其受体 1／2（VEGFR-1／2）、磷酸化的血管内皮生长因子受体（p-VEGFR-1／2）、内皮生长因子（EGF）、内皮生长因子受体（EGFR）及转化生长因子β1（TGF-β1）表达水平均下降，这提示沉默cZNF292的表达可抑制胶质瘤的血管生成。另外，胶质瘤细胞周期会停留在S／G2／M期，这是由调控细胞周期增殖的Wnt／β-catenin信号传导通路，包括轴蛋白（Axin）、β-链蛋白（β-catenin）、磷酸化转录激活因子 3（p-STAT3）、磷酸化转录激活因子5（p-STAT5）及其下游效应分子如周期蛋白 A（cyclinA）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK2）、多脯氨酸蛋白 11（PRR11）等表达失调所致，当然其中还涉及其他分子如 E2F1、NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1等的转录下调。而CyclinA的作用就是激活CDK2推动细胞增殖周期从S期进入G2期。然而更深层次的调控机制有待进一步研究。

3.5 circBRAF可以用来预测GBM患者的无进展生存期和总生存期circBRAF定位在7号染色体，由BRAF基因的外显子产生，BRAF基因可能与多种信号调节通路有关，包括Erb信号通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、mTOR信号通路。Zhu等［31］在研究中指出，相对正常脑组织，circBRAF的表达在胶质瘤患者低，而且高级别的GBM（WHO分级Ⅲ～Ⅳ）表达比低级别的GBM（WHO分级Ⅰ～Ⅱ级）低，提示circBRAF表达量高的GBM患者无进展生存期和总生存期较好。具体的机制尚不清楚，可能是因为下调表达环状RNA参与了神经营养因子信号通路。另外，Zhu等［31］在研究中发现了1411种差异表的达环状RNA，GO分析表明，下调的环状RNA与蛋白结合及修饰、转运活动、细胞器组织等有关，上调的环状RNA与受精、G0到G1期的转变、锰离子转运、精子获能、钙池操纵的钙离子通道活动、肌动蛋白依赖性ATP酶有关。

4 问题与展望

迄今为止，人们对circRNA认识大多数属于起步阶段，尤其是在胶质瘤领域，虽有研究表明胶质瘤涉及相关circRNA的改变，但深层次的机制仍不清楚，甚至部分环状RNA是否真正与胶质瘤有关仍需进一步研究，而且实验研究面临着仪器设备昂贵、技术要求高、分析普窄等问题。将circRNA应用于临床疾病诊治还有很长的路要走，但毫无疑问，对circRNA的研究可能为神经系统胶质瘤的诊治提供新的方向和思路，打开更为广阔的空间。