巩膜胶原交联术在近视中的研究进展

林晓 周浩

近视是致盲的主要疾病之一。2016年中国的一个大规模横断面研究[1]显示，近视在18岁学龄儿童中的发病率达到了80%，而在40岁及以上的成年人中达到了17%。近视发病率逐年增加，在2020年全世界将有1/3的人口罹患近视[2]。

目前尚无有效控制近视进展的方法，临床上应用的后巩膜加固术因长期效果不明确以及存在的并发症等原因尚存争议[3-4]。巩膜胶原交联法可以改变胶原的变性温度、机械强度和抗蛋白降解能力从而增强巩膜的力学强度，成为防治近视进展的新方法。近年来研究[5-8]表明，使用核黄素作为光敏剂辅以紫外光或蓝光照射的光化学交联法以及Tenon囊下注射甘油醛、京尼平及羟甲基甘氨酸钠等试剂的化学试剂交联法均可增强巩膜组织的硬度。

1 巩膜在近视发展中的变化

巩膜是决定眼球尺寸和屈光状态的关键[9-10]。巩膜由巩膜细胞及其细胞外基质组成，巩膜细胞外基质包含不同直径的胶原纤维、弹性纤维及纤维间质。巩膜细胞合成、降解细胞外基质成分[9-11]。巩膜的生物力学特征由胶原纤维的直径、分布和方向所决定[12]。在近视的发展过程中，肌成纤维细胞减少和收缩力下降，巩膜细胞外基质重塑，胶原减少，胶原分子内、分子间结构的不稳定和破坏，最终导致巩膜生物力学改变，如应力、应变参数值和弹性模量较正常眼低[9-10, 13-15]。综上所述，任何旨在缓解高度近视相伴随的视觉恶化的长期疗法，都应当以防治巩膜重塑为目标[9, 16]。

2 胶原交联术的原理

随着年龄增长,人的角膜胶原会发生酶或非酶介导的交联反应：酶参与调节的反应由赖氨酸氧化酶主导催化羟赖氨酸、赖氨酸与它们各自的醛基产生氧化反应，而后这些被氧化的醛基又与其他醛基产生分子内与分子间的交联[17]；非酶介导的反应则是通过胶原与葡萄糖及其氧化产物等的反应，降低胶原被降解位点的可及性从而减少胶原的降解，主要由糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)、化学交联剂(如戊二醛、无环β硝基醇、京尼平等)、光化学反应(如核黄素辅助的紫外光、蓝光的电离辐射作用)介导[18-19]。胶原交联术通过这些反应诱导胶原纤维之间形成共价键(交联)，提高胶原交联的密度，增加胶原纤维的直径，降低胶原被降解位点的可及性从而提高组织对蛋白水解酶的耐受性[20-22]。这一原理已被用于圆锥角膜的临床治疗中，近年来又被用于巩膜胶原交联的研究中[5-6, 22-27]。有研究[28]认为，4 nm以下的小纤维横向融合而使胶原直径增大，胶原直径与低负荷下的弹性模量呈正相关。胶原交联术可以通过提高巩膜胶原纤维之间共价键的密度、增加胶原纤维直径以及增强其对蛋白水解酶的耐受性，就近视眼巩膜胶原减少、胶原分子内或分子间结构的不稳定和破坏的特点有针对性地进行治疗，改变巩膜的生物力学特征。

3 巩膜胶原交联术

巩膜胶原交联术主要分为光化学交联法和化学试剂交联法。光化学胶原交联法使用核黄素辅助下的紫外光照射或蓝光照射，作用的部位主要包括在近视早期就开始出现力量减弱的巩膜赤道部，以及变化相对较晚较剧烈的巩膜后极部[9]。在Kwok等[29]的研究以前，光化学巩膜胶原交联法需要费时地进行眼球周围软组织解剖以暴露光照巩膜区域。化学试剂交联法则是在眼球的Tenon囊下注射化学试剂进行交联，这些化学试剂包括甘油醛[20]、京尼平[16]及羟甲基甘氨酸钠[8]等。化学试剂交联法不需手术暴露治疗区域，通过Tenon囊下注射的方式能够使液体在Tenon囊下沿球周扩散到达后极和赤道部巩膜[30]。

3.1 核黄素-紫外光交联巩膜胶原 核黄素-紫外光交联巩膜胶原的原理为非酶介导的光化学反应。光化学交联反应只在核黄素被紫外光激发的地方发生：光敏剂核黄素吸收370 nm 或430 nm波长的紫外光的能量被激发到三线态，产生单线态氧为主的活性氧族[21]。在氧气充足时，活性氧族可以持续与胶原纤维的羰基团发生Ⅱ型反应；在氧气被紫外光耗尽时，则发生Ⅰ型反应[31]。光化学反应介导胶原的氨基酸分子内或分子间产生共价连接(交联)，从而提高胶原纤维的机械强度和抗蛋白酶消化的能力。核黄素在反应中可以起到减少其对组织的穿透性损伤的保护作用。

Wollensak等[23]先用0.1%核黄素浸润兔眼球赤道部到后极部的巩膜5 min，并在术前5 min开始每隔5 min 用核黄素溶液浸润眼球，用能量4.2 mW/cm2、波长370 nm的紫外光照射兔眼的巩膜30 min，通过对其应力-应变的分析发现交联处理1 d后虽然极限应力较对照组可增加227.9%，极限应变减少54.52%，却存在视网膜损伤。2009年，Wollensak等[24]用波长370 nm、能量为3 mW/cm2的紫外光在0.1%核黄素溶液作为光敏剂预先处理过的兔眼赤道部巩膜照射30 min，发现实验眼兔巩膜的杨氏模量在8个月时较对侧眼高502%，同时极限应力较对侧眼巩膜高213.8%，此时没有组织损伤。Wang等[25]在实验开始时及实验期间每分钟用核黄素溶液浸润兔眼球，用365 nm 波长、3 mW/cm2能量的紫外光作用于兔的右眼赤道部巩膜，以相同的核黄素处理兔的左眼赤道部巩膜作为对照组，用视网膜TUNEL染色法检测标本，发现交联组兔的视网膜上较非交联组有更多的凋亡细胞，电镜下出现视网膜光感受器层细胞线粒体的肿胀和线粒体嵴消失，术后1周、1个月、3个月后患眼较对侧眼的暗适应视网膜电图波幅显著减少。他们据此认为，此方案从术后兔视觉功能重建的角度来说并不足够安全。照射总能量、照射方案都是影响光化学胶原交联法造成组织不同损伤程度的因素。高能量强度的紫外光联合短时间照射与低能量强度联合长时间照射，结果可能不同。Dotan等[32]在照射前20 s及照射期间每20 s应用0.1%的核黄素溶液浸润照射区域，并用57 mW/cm2能量、370 nm波长的紫外光在形觉剥夺法诱导近视的兔眼的赤道部巩膜照射较短的时间(200 s)，在术后55 d对比发现实验组与对照组的眼轴增长数值具有显著差异，证明此方案达到了减缓眼轴延长的效果；同时，所有交联组的兔巩膜组织学检查均没有发现坏死、炎症、萎缩等反应。Liu等[5]发现，以0.1%核黄素溶液为光敏剂在离焦性近视的豚鼠模型的巩膜赤道部及后极部应用370 nm波长、57 mW/cm2能量的紫外光作用300s后的交联组，较对照组有较高的巩膜的强度，且眼轴的延长更少；术后6周在光镜下没有发现视网膜等邻近组织的损伤。

3.2 核黄素-蓝光交联巩膜胶原 核黄素-蓝光的交联原理与核黄素-紫外光相似。应用光照法时，光的波长越大穿透性越大，并且造成生物损伤的可能越小。波长450 nm左右的蓝光比波长365 nm左右的紫外光有着更大的穿透深度，可能对巩膜和视网膜组织损伤更小[26-27, 33-34]。

Iseli等[33]在2008年首次介绍了核黄素联合蓝光照射交联法。他们用0.5%核黄素溶液作为光敏剂，26 mW/cm2能量、465 nm波长的蓝光照射成年兔赤道部巩膜20 min，在4周后由应力-应变曲线证明了蓝光可以使兔巩膜变硬，在光镜下无视网膜损伤。Iseli[26]等以金吉拉和新西兰幼兔为实验对象，用5%核黄素溶液作为光敏剂联合蓝光照射兔巩膜，并将蓝光的能量梯度设定为7组(15、40、80、150、200、400、650 mW/cm2)，发现400 mW/cm2及以上能量的蓝光在2种兔中，都会引起视网膜细胞变性及大量胶原组织结构改变的病理性改变，这些改变局限于治疗区域。15 mW/cm2能量的蓝光照射可以显著减慢兔眼球生长，并且可以维持稳定24周[6, 26]。Schuldt等[35]用450 nm波长、能量在12～100 mW/cm2内的不同能量梯度的蓝光分别照射离体巩膜条带，分析其弹性模量 (elastic modulus, G′)、粘滞力模量(viscous modulus, G〞)等力学特征，发现核黄素-蓝光照射可以提高巩膜的G′和G〞，并且相对弹性模量(relative elastic modulus， ΔG′，照射组/对照组)的值在12 mW/cm2及25 mW/cm2为1.5，50 mW/cm2或100 mW/cm2的照射方案下ΔG′为1.8，而在200 mW/cm2时ΔG′降低为1。在蓝光的强度在100 mW/cm2内时巩膜的硬度随着蓝光的强度升高而升高，在没有光敏剂核黄素溶液的情况下单独应用核黄素或蓝光(能量均为25 mW/cm2)均不能改变巩膜组织的弹性模量。2017年，Kwok等[29]用聚二甲硅氧烷弹性体制成厚度在1.5 mm内的锥形光波导管，由此易于弯曲的导管导入波长445 nm、能量分别为25 mW/cm2和50 mW/cm2的蓝光，对新鲜猪眼赤道部的巩膜环绕交联30 min。此研究发现与8%应变对应的杨氏模量分别为(10.9±1.2)Mpa及(10.7±1.0)Mpa，均分别与相应光照能量强度下用直接核黄素联合光照法照射过的对照组猪巩膜的杨氏模量没有差异。这种光照法突破了此前物理交联法照射范围较小(10～100 mm2)的局限之处，可以实现单次长于7 cm的光照范围，并提高了光照的均匀一致性[29]。

3.3 Tenon囊下注射化学试剂交联巩膜胶原 目前应用于巩膜胶原交联的化学交联法的试剂有甘油醛[7, 36]、戊二醛[37]、无环β硝基醇[38]、京尼平[16]和甲醛释放剂(formaldehyde-releasing agents, FARs)[39]等。甘油醛为糖代谢的中间产物，无毒，而且有很高的交联特性[39]。赖氨酸氧化酶作用于胶原大分子产生的分子间反应是醛类衍生物交联组织的本质；除此以外，甘油醛还有着非酶糖基化的通路。非酶糖基化是糖醛化合物的醛基与蛋白质分子如赖氨酸之间发生非酶化学反应(Maillard反应)，生成AGEs，使组织坚固且增加了对降解组织酶的抗性[40-41]。

2008年，Wollensak等[20]在14 d内于Tenon囊下注射0.15 mL浓度为0.5 mol/L的甘油醛溶液5次，发现试验结束时被交联的兔巩膜较对照组的杨氏模量和极限应力都得到了显著提高，兔角膜缘及眼外肌处出现轻微的炎性浸润及少量角膜细胞，视网膜不受影响。同年，Wollensak等[36]研究这种交联方法对巩膜生物力学性质的长期效果，发现术后第4个月、8个月巩膜的杨氏模量分别增加989.6%、554.17%，极限应力分别增加325%、254.17%，极限应变减少58.84%、37.24%。此巩膜胶原交联方法可长期(至少8个月)有效增强巩膜的生物力学性质且未出现组织损伤[36]。Chu等[7]发现，在形觉剥夺诱导近视4周的豚鼠于Tenon囊下每周注射2次0.5 mol/L浓度的甘油醛，实验结束时巩膜条带的杨氏模量和应力增加，但眼轴却没有得到控制。他们分析其原因为豚鼠在短期的近视模型期间不会出现巩膜胶原变细，在此研究中被提高的巩膜硬度不足以在形觉剥夺的豚鼠模型减缓其近视的进展。此外，有研究[42]报道，由于甘油醛诱导形成AGEs，使巩膜特别是筛板处变硬，弹性下降，可增加青光眼模型小鼠的视网膜神经节细胞的损伤易感性。戊二醛有一定的毒性，可引起支气管炎及肺水肿，其安全性有待考量[37]。无环β硝基醇在生理情况下可以作为甲醛和亚硝酸盐释放剂从而交联胶原组织。巩膜条带热收缩实验表明，硝基较多的高级硝基醇化合物(higher order nitroalcohols, HONAs)比单个的硝基醇化合物有着更高的交联效能[38]，但该方法尚未进行体内实验，远期疗效以及毒副作用尚不明确。京尼平是一种从栀子花中提取的天然交联剂，其细胞毒性低于戊二醛和环氧化合物。在单眼形觉剥夺21 d的豚鼠Tenon囊下注射0.1 mL浓度为0.5%的京尼平可以提高其巩膜的硬度并减缓眼轴延长[16]，但这种交联剂的长期安全性和有效性仍待探讨。FARs是最新的交联剂,它作为防腐剂存在于流行的化妆和个人护理用品中[39]。Babra等[39]从5个FARs中筛选低毒的组织交联试剂，以2种HONAs作为对照，发现在一定条件下双咪唑烷基脲和羟甲基甘氨酸钠与BNAs相比，效能更高而细胞毒性相似。Planar 细胞培养实验显示，FARs对细胞的毒性高于甘油醛而低于戊二醛[39]。2017年，Zyablitskaya等[8]以离体的兔头为实验对象，用40 mmol/L及400 mmol/L浓度的羟甲基甘氨酸钠在Tenon囊下注射400 μL后用共聚焦显微镜进行观察，并用巩膜条带的热变性实验来分析交联效果，发现在注射位点及周围的巩膜胶原显示出更高的信号，被交联的巩膜有更大的胶原束。目前，还没有研究在动物模型验证FARs交联巩膜的有效性和安全性。

4 结语

综上所述，胶原交联术可以通过诱导性的胶原交联改变巩膜的生物力学特征，通过增强巩膜的抗扩张力从而控制近视进展。然而，不同物种之间巩膜结构具有明显差别，交联参数如波长、照射时长、照射部位的变化也将导致交联效果不同。所以，只有对近视动物模型乃至于人进行巩膜胶原交联术的研究，才可以将此类技术应用至临床。此外，胶原交联术在应用于临床前还需要通过动物实验解决如下问题：①目前研究多是对巩膜条带进行分析，缺乏再现活体眼内的巩膜力学特征的方法，模拟活体的巩膜状态的力学测定方法仍需进一步探索；②通过胶原交联法交联过的巩膜是否能在整个眼球发育期间抵抗近视的眼球扩张；③如何避免不同光化学交联方案及化学交联剂对视网膜的潜在毒性作用，如何避免交联引起的副作用，如甘油醛交联法增加青光眼模型CD1小鼠视网膜神经节细胞的损伤易感性[42]。