我国猪流行性腹泻疫苗研究与应用现状

2018-01-16王文秀谢金文沈志强

养猪 2018年1期

李娇，王文秀，谢金文，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性、病毒性肠道传染病[1]，一直是严重威胁仔猪健康养殖的主要疫病之一。尤其自2010年末开始，我国猪场从南到北，从东到西陆续暴发了由PEDV变异毒株引起的以新生仔猪严重呕吐、水样腹泻和高病死率为主要特征的腹泻疫情[2]。目前PEDV变异毒株已是我国PEDV流行的优势毒株，变异毒株在我国猪群中的流行已不容忽视，甚至普遍认为变异型PED将是未来几年内危害仔猪最为严重的腹泻病之一[2]。疫苗接种是预防控制PED的主要手段，自PEDV出现以来，针对PED疫苗的研究一直都在持续进行，过去受病毒培养困难等条件限制，PED疫苗研究与应用一直受阻，直到Hofmann等[3]研究发现在培养液中添加胰酶可提高PEDV在Vero细胞的适应性，使PED疫苗研究与生产得到迅速发展。目前我国商品化的PED疫苗主要有传统PEDV灭活苗和弱毒苗，但灭活疫苗存在对猪的免疫保护力较弱、灭活不完全导致病毒扩散风险等缺陷，弱毒疫苗存在毒力增强、易产生变异株等缺陷。同时，随着PEDV病原学和分子生物学研究的不断深入，其免疫机理日益清楚，PEDV以典型的局部黏膜免疫为主，存在于血清中的IgG不能提供完全保护，只有肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体（SIgA）才能抵抗PEDV感染，哺乳仔猪通过初乳获得母源SIgA，从而产生针对PEDV的被动免疫保护。就目前我国PED流行现状而言，疫苗免疫仍是控制该病发生、流行和降低高病死率的最佳方法，疫苗应用依然是PED预防和控制的主要途径。本文综述了我国研究学者在PED灭活疫苗、弱毒疫苗等传统疫苗以及亚单位、活载体疫苗等基因工程疫苗方面的研究与应用现状，以期为新形势下进一步开展PED疫苗的研发提供借鉴与参考，对制定和优化我国PED综合防控措施具有一定的参考价值。

1 传统疫苗

1.1 灭活疫苗

PEDV灭活疫苗是最常规的疫苗，制造工艺简单，直接用人工繁殖获得病原微生物，经灭活后作为抗原，具有安全、可靠的特点。目前，已经商品化的灭活疫苗为猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗。徐宏军等[4]为研究PEDV常规疫苗毒株对现流行变异毒株的免疫保护效果，分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺制备了PEDV转瓶灭活苗与悬浮灭活苗，免疫攻毒保护试验显示悬浮灭活苗对仔猪保护率达80%，转瓶灭活苗对仔猪保护率仅为20%，表明提高PEDV常规疫苗株的抗原含量，能够有效提高常规灭活疫苗对PEDV流行变异毒株的保护效果。为筛选能用于变异型PEDV疫苗研发的流行毒株，代洪波等[5]进行PEDV变异毒株的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效果研究，结果显示以PEDV-JX12分离株制备的灭活疫苗免疫母猪，对哺乳仔猪的保护率达93.75%，表明PEDV-JX12分离株能够适应细胞培养，免疫接种母猪能给哺乳仔猪提供有效保护，可用于变异型PEDV流行毒株的疫苗研发。灭活疫苗性质比较稳定，易于保存和运输，抗原含量达到一定水平后免疫母猪，可以有效防控哺乳仔猪PEDV的发生和流行。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一种将病原的致病力减弱但仍然具有活力的完整病原疫苗，将其接种动物后类似自然感染过程，在动物体内停留一段时期即可增殖产生大量抗原，可同时诱导较强的细胞免疫反应和体液免疫反应，产生良好的免疫保护效果，具有使用剂量小、免疫原性好、不需佐剂、成本低、使用方便等优点。通过筛选获得PEDV弱毒疫苗株，即可制备出安全、效价高的弱毒疫苗，目前已经实现商品化的弱毒疫苗株有猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联活疫苗、猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联活疫苗，PED使用的弱毒疫苗株主要有CV777株、P-5V株、KPED-9株和DR13株。但研究学者对我国2010年以来PEDV流行毒株的分子流行病学调查发现目前流行毒株与CV777等疫苗毒株相比，毒力基因发生了较大的改变[6-7]，由此推测以CV777株为代表的疫苗毒株对猪群的保护力不足，造成免疫失败[8]。故毒株的选择及其免疫原性、毒价是弱毒疫苗研发和生产应用的关键技术指标，在PEDV流行毒株不断发生变异的情况下，筛选并致弱免疫原性、毒价高的变异毒株是研发新型PEDV弱毒疫苗的紧要任务和必由之路。

2 基因工程疫苗

随着现代生物学技术日新月异的发展，基因工程疫苗逐渐成为PED疫苗研究的热点。目前利用基因工程技术已经和正在研制开发的PED新型疫苗主要有腺病毒重组疫苗、枯草芽孢杆菌重组疫苗、转基因玉米疫苗、大肠杆菌表达的亚单位疫苗、杆状病毒表达的亚单位疫苗、毕赤酵母表达的亚单位疫苗，但均位于试验研究阶段，均未实现商品化生产。

2.1 腺病毒重组疫苗

腺病毒载体已被广泛用于疫苗开发，是一种安全有效的活病毒载体。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）属于造血生长因子，能够刺激免疫细胞产生细胞因子，增强抗原递呈细胞功能，在机体免疫调节中起重要作用，能增强疫苗的免疫效果，具有免疫佐剂的功能。赵攀登等[9]利用腺病毒表达系统构建了串联表达GM-CSF和PEDV S1蛋白的重组腺病毒，经间接免疫荧光和Western-blot检测显示，S1和GM-CSF蛋白在重组腺病毒中获得表达，该重组腺病毒的获得为PEDV腺病毒重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

2.2 枯草芽孢杆菌重组疫苗

枯草芽孢杆菌在缺乏营养或其他迫胁条件下，芽孢衣壳蛋白基因能表达一种抗逆性的休眠体—芽孢，以外层芽孢衣壳蛋白为分子载体，通过芽孢表面展示技术将外源目的蛋白展示于芽孢表面，既能制备出具有特定生物活性的重组芽孢。重组芽孢不仅具有外源蛋白特有的生物活性，而且还携带芽孢本身独特的抗逆性，能够长期存活并顺利通过胃肠屏障激发肠道黏膜免疫。戴茜茜等[10]将PEDV S蛋白保护性抗原片段COE1与枯草芽孢杆菌芽孢外层衣壳蛋白基因cotB进行重组，构建融合表达cotBCOE1的整合型重组质粒，重组质粒与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE双交叉，获得重组枯草芽孢杆菌，对重组枯草芽孢杆菌进行淀粉酶活性分析、PCR鉴定、Western-blot分析、免疫荧光试验，表明PEDV S蛋白保护性抗原片段COE1成功地展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，且保护性抗原片段具有良好的免疫原性，为研制PEDV新型、口服枯草芽孢杆菌重组疫苗奠定了基础。

2.3 转基因玉米疫苗

利用转基因植物生产动物基因工程疫苗用于疾病的预防及治疗已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。满坤等[11]根据玉米密码子的偏好性，设计合成优化的PEDV主要中和抗原表位COE编码基因，构建了植物表达载体pBAC9036，将其转化玉米自交系501的幼胚，通过分化再生培养和田间草甘膦抗性筛选获得了2个转基因玉米稳定株系，经PCR、间接ELISA和Western-blot等鉴定表明COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达，分别提取转基因玉米稳定株系叶片和种子的可溶性蛋白提取物，分别与佐剂混合后皮下注射小鼠，免疫小鼠均可产生针对PEDV COE基因的特异性抗体。表明成功获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白，且表达产物具有显著的免疫原性，为进一步开发PEDV转基因玉米疫苗奠定了基础。

2.4 大肠杆菌表达的亚单位疫苗

原核表达系统无法对表达的外源蛋白进行翻译以及翻译后的加工和修饰，但原核表达系统以其培养方便、操作简单、成本低廉、表达量高、易于纯化等优点，仍然成为外源蛋白表达的首选表达系统。桂锐等[12]将PEDVS1基因主要抗原区域克隆至pET-30a原核表达载体，构建原核表达质粒，转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组蛋白，Western-blot分析显示重组蛋白能够被PEDV多抗血清特异性识别，具有良好的反应原性，为进一步研制亚单位疫苗奠定了物质基础。

2.5 杆状病毒表达的亚单位疫苗

杆状病毒表达载体系统是一个以杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统，其表达后的产物可进行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等在内的翻译后加工和修饰，保证了所表达的重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白。谭博敏等[13]将PEDV主要抗原表位S1和M基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中，构建了重组转移质粒pFBD-S1-M，并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M，转染Sf9昆虫细胞后，拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M，经SDS-PAGE和Western-blot检测表明，表达产物能与PEDV多克隆抗体发生特异性反应，表明共表达的蛋白具有良好的反应原性，为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。2.6 毕赤酵母表达的亚单位疫苗

巴斯德毕赤酵母表达系统兼有原核表达系统和真核表达系统的优点，操作方便、生长快速、表达量高，又能对外源蛋白进行翻译以及翻译后加工和修饰。胡青松等[14]将PEDV S蛋白部分保护性抗原COE基因导入毕赤酵母表达载体，构建毕赤酵母pPIC9K-COE重组质粒，并电转化入酵母感受态细胞GS115中，筛选高拷贝阳性重组菌进行诱导表达，SDS-PAGE和 Western-blot分析表明 PEDV COE基因可在毕赤酵母中获得分泌表达，且表达的重组蛋白具有很好的生物学活性，病毒中和试验表明重组蛋白免疫后的小鼠血清中能够检测到PEDV特异性中和抗体，为利用巴斯德毕赤酵母表达系统开发PEDV亚单位疫苗奠定了基础。

3 小结与展望

PED发病急、病程短，猪只年龄越小死亡率越高，近几年来变异型PED成为影响我国仔猪健康的最重要病毒性肠道传染病，研发和应用安全、有效的PED疫苗对控制和清除PEDV至关重要。对于PEDV的疫苗，灭活疫苗只能诱导体液免疫，仔猪只能通过哺乳获得SIgA，保护效果不佳，弱毒疫苗存在散毒和返祖的危险，同时现有灭活疫苗和弱毒疫苗抗原含量均偏低，且疫苗株对PEDV变异毒株的保护效果不确切。故筛选以临床分离培养的变异毒株作为疫苗候选毒株，优化和改进现有的商品化疫苗，驯化出免疫原性好且毒价高的弱毒株将是PEDV常规疫苗研发和产业化的重点。PEDV基因工程疫苗尚处于研究阶段，但新型基因工程疫苗通过口服可以在肠道快速定植，产生SIgA抗体，达到理想的黏膜免疫效果，其将在PED防控中起到越来越重要的作用，将具有广阔的开发和应用前景。相信随着分子生物学、免疫学、基因工程技术的不断发展，以及PEDV致病机理和免疫机制研究的不断深入，PEDV疫苗研究均将逐步得到完善，不断为我国PED的综合防控提供技术保障。

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