HPLC法测定喜树嫩叶和成熟叶中喜树碱含量季节性变化

刘波，杨梓桐，刘曦子，苏禄晖，傅颖，朱丽红，杨意

（1.上海市医药学校，上海 200135；2.上海市新竹园中学；3.南京大学金陵学院化学与生命科学学院；4.上海市浦东新区公路管理署）

喜树（Camptotheca acuminata Decne.）为珙桐科（Nyssaceae）喜树属（Camptotheca Decne.）植物，为我国特有高大落叶乔木，主要分布于我国长江流域、西南各省区及印度部分地区，属于国家二级保护树种［1-2］。喜树根、茎、叶、果实及种子中提取的喜树碱（camptothecin，CPT）是迄今为止发现的唯一一种拓扑异构酶I（Topoisomerase I）的抑制剂，具有广谱抗癌活性，可用于胃癌、直肠癌、慢性粒细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病的治疗［3-4］。进入20世纪90年代后，美国、日本和英国等国家先后开展了对喜树的研究和开发，喜树成为继红豆杉之后又一个重要的木本抗癌药用植物，成为世界性热门研究课题。目前CPT可于喜树各组织中分离获得［5］。

近年来，国内学者对CPT的研究取得了一定的成果［6-11］，但对喜树叶中CPT含量的季节性变化研究较少［12-13］。喜树叶作为CPT生产原料，不仅采收方便、受季节影响较小，且科学合理的采集量亦能减少对喜树资源和生态环境的破坏，有利于喜树资源的持续发展与利用，且研究表明，喜树各组织中，嫩叶中CPT含量可以达到植株地上部分平均含量的4倍［13-14］。本研究应用HPLC法对喜树嫩叶和成熟叶中CPT含量的季节性变化规律进行测定，以确定喜树叶片采收的最佳时期，提高资源利用率和生产率，并对建立的HPLC法测定喜树叶中CPT含量测定方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料 一年生、三年生和五年生喜树，种源为四川都江堰。以植株新梢上的嫩叶（枝顶1～3位叶）和成熟叶（枝条中下部叶，叶片深绿色）作为试验材料。2016年4至11月，于每月中旬、月底采集喜树嫩叶和成熟叶。采集时间均为早上9：00。所有样品采集后均用清水洗净，60℃烘干，恒重，粉碎至60目，干燥器中保存备用。1.2 仪器与试剂 Jasco高效液相色谱仪（英国VG公司）、975型紫外检测器（英国VG公司）、TG328A型电子天平（上海天平仪器厂）、Heraeus Biofuge 22R型高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）、BuchiR210型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）、索氏提取器（天津玻璃仪器厂）。乙腈（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、95%乙醇和蒸馏水。

1.3 色谱条件 色谱Waters ODS柱（25 cm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-水（V/V 4∶6）；流速1 m l/min；检测波长 254 nm；进样量 10 μl；柱温25℃。

1.4 标准曲线的绘制 精密称取CPT标准品（购自Sigma公司）3.5mg，置于100ml容量瓶中，以乙腈-水（V/V 4∶6）为溶剂，超声溶解并稀释至刻度，摇匀、定容，备用。分别精密吸取CPT 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0m l于10m l容量瓶中，用相同溶剂定容至刻度，摇匀。按照上述色谱条件，分别取稀释后样品及原标准溶液进行分析，每个样品重复测定3次，取峰面积的平均值。得峰面积（Y）与CPT浓度（X）的线性回归方程：Y=1807.49X-1343，相关系数R2=0.9995。

1.5 CPT提取 精密称取干燥喜树叶粉3.000 g，用30 ml 95%乙醇，索氏提取8 h，提取3次，合并提取液。用移液管精密吸取提取液200μl，移入2ml离心管中，用95%乙醇稀释6倍，12 000 r/min条件下离心5min，精密吸取上清液，直接进样，计算CPT提取率。

1.6 精密度测定 为考察进样精密度，每次精密取标准品液10μl，连续进样5次，测得CPT峰值分别为60839.229、61045.234、60969.247、61099.508和60799.394，根据均值和标准差求得RSD为0.1896%，说明实验精密度较好。

1.7 重现性实验 将同批样品平均分成3等份，按1.5项方法提取CPT，并按1.3项的色谱条件进行CPT含量测定，测得CPT含量分别为0.6998‰、0.6828‰和0.7192‰，均值为0.7004‰，根据均值和标准差求得RSD为2.1556%。方法重现性好，所得实验结果可靠。

1.8 回收率测定 精密称取样品5份，分别加入适量CPT标准品，按1.5项方法提取CPT，分别测定并计算回收率。结果加样提取回收率分别为98.64%、102.14%、98.03%、100.21%和99.44%，平均回收率为99.69%，根据均值和标准差求得RSD为1.6016%。

2 结果

2.1 喜树叶片中CPT含量的季节性变化 对于三年生喜树，在其一年生长过程中，嫩叶和成熟叶中CPT含量均为单峰曲线。从4月份至7月份，嫩叶与成熟叶中CPT含量均为上升趋势，其中嫩叶、成熟叶均在7月中旬含量达到最大值，分别为1.0927‰和0.6998‰；然后嫩叶与成熟叶中CPT含量均呈降低趋势，嫩叶与成熟叶中CPT含量均在11月份最低，分别为0.1314‰和0.0689‰。在整个生长期内，嫩叶中CPT含量均高于同期成熟叶中的CPT含量。见图1。

图1 不同月份喜树叶片中CPT含量变化

2.2 不同树龄喜树叶片中CPT含量比较 树龄不同，喜树叶片中的CPT含量亦不相同。随着树龄的增大，其叶片中的CPT含量呈下降趋势，即一年生喜树叶片中CPT含量＞三年生喜树叶片中CPT含量＞五年生喜树叶片中CPT含量。见图2。

图2 不同树龄喜树叶片中CPT含量变化

3 讨论

本研究结果显示，在喜树一年生长过程中，无论是嫩叶还是成熟叶，CPT含量变化均为单峰曲线，这一研究结果与张玉红等［12］的研究结论相同，且嫩叶与成熟叶中CPT含量最高值均出现在7月中旬，主要是这个时期，光照、水分及其他生态因子均适宜喜树生长，喜树的各种生理活动旺盛，合成的次生代谢产物CPT的速率较快。而郭勇等［13］研究显示，喜树无论是嫩叶还是成熟叶，在生长期内，其CPT含量变化均为双峰曲线，分别在6月和9月达到峰值，其中以6月份CPT含量最高。植物体内经常是多种生物碱并存，它们在量上的比例可能受遗传基因的控制，且随不同生长发育时期进行转化或消长［15］。因此对不同树龄喜树叶片中CPT含量动态变化进行研究具有现实意义。本研究结果显示叶片中的CPT含量随着树龄的增大而降低。Liu等［14］研究发现，叶片中的CPT含量会随着树龄增大呈现迅速下降的趋势，与本研究结果一致。

本研究中，HPLC法测定喜树嫩叶和成熟叶中CPT含量，CPT含量与峰面积在0.035～0.35mg范围内线性关系良好（R2=0.9995）；精密度和稳定性较好，方法重现性好，喜树碱回收率较高，平均回收率达99.69%。说明应用HPLC测定喜树嫩叶与成熟叶中CPT含量的季节性变化的方法准确可靠。经研究发现，CPT及羟基CPT均有较强的紫外吸收，其中以CPT的吸收更强［13］，故用HPLC法测定CPT含量专属性强，分析速度快，灵敏度高。

马锦星等［15］应用HPLC测定羟基CPT及CPT含量，研究结果表明，HPLC法可作为原料及其制剂的含量测定方法。黄瑞松等［8］通过HPLC法对不同产地喜树果中的CPT含量进行了测定，结果显示，建立的喜树果定量测定方法准确可靠。王轶等［16］等建立了HPLC-荧光检测测定方法测定微量喜树样品中的CPT，这一方法仅需2mg干质量植物样品即可实现对CPT的测定，对HPLC法测定CPT进行了探索改良，为微量植物材料中CPT的测定提供了有效方法。

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