p IRES-PM L-RARα-IFN-γ重组质粒体外表达检测

胡刚，王旭，李扬秋

（1.广东省惠东县人民医院内六科，广东 惠东 516300；2.暨南大学医学院血液病研究所；3.暨南大学再生医学教育部重点实验室）

联合化疗和诱导分化治疗已经显著改善了急性早幼粒细胞白血病患者的预后，但微小残留病变的存在，成为患者日后复发的根源。在患者处于疾病缓解期，利用白血病疫苗诱导患者产生抗白血病的特异免疫反应，是一种理想的预防白血病复发的方式。前期研究表明利用PML-RARα基因片段与白细胞介素2（IL-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等构建的重组表达载体能够诱导特异性免疫应答［1-3］。本研究旨在检测我们前期构建的pIRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒在真核细胞中的表达情况，为急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的研发提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料 p IRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒由暨南大学血液病研究所实验室构建并保存，A549细胞株购自北京天为时代公司。

1.2 方法

1.2.1 构建好的载体转染A549细胞 取适量A549细胞（约6×105个）平铺在不含抗生素的培养基上。用IMDM培养基（北京天为时代公司）将待转染的A549细胞稀释20倍后，将这些细胞置于显微镜下进行计数。取出适量的细胞液用离心机以600 r/min的转速离心5min后，用IMDM培养基对离心后的细胞进行重悬处理，经过处理后的细胞浓度为1.2×106/ml。取一个做好标记的24孔板，板上的每个孔中加入500μl经过重悬处理的细胞液，加入细胞液后板上每个孔的细胞数目约为6×105个。（2）将重组载体质粒加入到适量Opti-MEM®I培养基中（北京天为时代公司，该培养基不含血清），在室温下轻轻摇动混合均匀，然后在室温下孵育5min。（3）向装有待转染细胞液的培养板中分别加入适量DNA-Lipofectamine™2000复合物，然后轻微晃动培养板使细胞液与复合物混合均匀。（4）将含有细胞液和复合物的培养板放入二氧化碳培养箱中在37℃条件下进行培养4～6 h，然后取出培养板，更换其中的培养基，更换后的培养基含有胎牛血清和抗生素，将该培养板置于二氧化碳培养箱中继续培养48 h后收集细胞和上清液。

1.2.2 RT-PCR法检测外源质粒在真核细胞中的表达 收集转染后培养48 h的A549细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，分别用引物P1、P2（用于扩增PML-RARα基因，384 bp）和引物P3、P4（用于扩增IFN-γ基因，553 bp）进行PCR扩增，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶在100 V电压下电泳。P1、P2引物序列：P1：5'-CAAGCTAGCA GCATGGTCTCCAATACAACGA-3'，P2：5'-GCGAC GCGTTCAGTCCTGACAGACAAA G-3'；P3、P4引物序 列 ：P3：5'-GCTCTAGAGATTTCA ACTTCTTT GGCTTA-3'，P4：5'-TTGTCGACGCAGG CAGGAC AACCATTACT-3'。

1.2.3 ELISA法检测IFN-γ蛋白的表达 将ELISA试剂盒（杭州联科生物技术公司）中的各种试剂按照操作要求配制成标准品，标准品浓度如下：2.05、5.12、12.8、32、80、200、500 pg/m l。向反应板各加样孔中加入不同浓度标准品和标本，每个加样孔中的加样量为100μl，封闭加样孔，将反应板置于37℃温箱中孵育90min。按照操作常规进行洗板（共计4次），向每一个加样孔中加入经过生物素标记的抗体，封闭加样孔，置于37℃温箱中孵育60min。按照操作常规洗板（共4次），向各加样孔中加入酶结合物，封闭反应孔，将反应板置于37℃温箱中孵育30min。洗板4次，向各加样孔中加入显色剂，避光条件下孵育20 min（37℃）。向各加样孔中加入反应终止液。以含有终止液和显色剂的孔作为空白孔，分别在酶标仪上将各加样孔中的液体混合均匀后即刻测量OD450值。

1.2.4 Western blot法检测PML-RARα蛋白的表达 应用Western blot试剂盒（杭州联科生物技术公司）进行检测，收集转染后的A549细胞上清液，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白质浓度。样品与等体积的2×上样buffer混匀，煮沸5 min用7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）首先100 V/70 V电泳30min，然后换120 V/110 V电泳50min，分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜，用现配的Blocking buffer室温孵育2 h。孵育一抗，4℃过夜。用PBST洗涤3次后孵育二抗1 h。将1：1配置的显色液加到膜上，可立即显色，然后进行照相。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 RT-PCR产物检测结果发现第2、3泳道均出现大小为384 bp的条带，这说明含有目的基因的重组质粒都已经成功地转染到了A549细胞中，并且这些重组质粒能够在A549细胞中进行正常转录。见图1。

图1 转染后的A549细胞cDNA RT-PCR产物电泳图

2.2 ELISA检测结果 各标本的OD450值检测结果见表1。利用标准品OD450值制作的IFN-γ标准曲线见图2。

表1 标准品的OD450值检测结果

标本样品检测的OD450值结果见表2。由该曲线可以查出标本4、标本5和标本6中IFN-γ的浓度分别约为5.66、8.52和10.5 pg/ml，根据ELISA实验结果绘制的标本样品中IFN-γ浓度条形图见图3。

图2 IFN-γ标准曲线

表2 标本样品检测的OD450值结果

图3 ELISA检测IFN-γ浓度条形图

2.3 Western blot检测结果 Western blot检测获得的PML蛋白表达情况见图4。

图4 Western blot检测PML蛋白表达

3 讨论

伴随着生物科技的进步，白血病的治疗手段也有了日新月异的变化，但是各种治疗手段都面临着一个问题，那就是如何根除患者体内的微小残留病变。免疫治疗是有可能根除微小残留病变的方法之一。许多白血病患者体内都存在由于染色体易位导致的融合基因，这种融合基因既是致病的根源，也是免疫治疗的重要靶点。将白血病患者体内特定的融合基因插入到相应的载体中构建DNA疫苗，将该疫苗注射到患者体内有可能诱发患者产生针对含有该融合基因的白血病细胞的免疫效应，这一构思在体外和动物试验中得到了初步证实［4］。对BCR-ABL和PML-RARα融合基因的研究比较充分［4-6］，许多研究都采用这两种融合基因用于构建DNA疫苗，但是这些DNA疫苗的免疫原性却不尽人意。如何提高疫苗的免疫原性，是DNA疫苗研发时所面临的一个关键问题。

IFN-γ主要由活化的T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）产生，IFN-γ能够诱导巨噬细胞、T细胞、B细胞等细胞MHC-Ⅱ分子表达，从而提高抗原提呈能力，因此可以作为佐剂用于增强DNA疫苗的免疫原性。本研究率先成功构建了pIRESPML-RARα-IFN-γ双表达载体，并且该载体能够在真核细胞中进行正常转录和翻译。下一步我们将利用构建的p IRES-PML-RARα-IFN-γ双表达载体进行动物实验，争取为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病提供更多资料。

［1］ Lin C，Li Y.The role of peptide and DNA vaccines in myeloid leukemia immunotherapy［J］.Cancer Cell Int，2013，13 （1）：13.

［2］ Li Y，Lin C，Schmidt CA.New insights into antigen specific immunotherapy for chronic myeloid leukemia［J］.Cancer Cell Int，2012，12（1）：52.

［3］胡刚，周羽竝，岑东芝，等.PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达［J］.江苏医药，2013，39（8）：878-881.

［4］Sun JY，Krouse RS，Forman SJ，etal.Immunogenicity ofa p210（BCR-ABL） fusion domain candidate DNA vaccine targeted to dendritic cells by a recombinant adeno-associated virus vector in vitro［J］.Cancer Res，2002，62（11）：3175-3183.

［5］Osman Y，TakahashiM，Zheng Z，et al.Dendritic cells stimulate the expansion of PML-RAR alpha specific cytotoxic T-lymphocytes：its applicability for antileukemia immunotherapy［J］.JExp Clin Cancer Res，1999，18（4）：485-492.

［6］Padua R A，Larghero J，Robin M，etal.PML-RARA-targeted DNA vaccine induces protective immunity in a mouse model of leukemia［J］.NatMed，2003，9（11）：1413-1417.