某院下呼吸道流感嗜血杆菌耐药分析*

王小龙，汪永强，袁平宗，张淑霞，黄作富，杨玉霖

(四川省内江市第二人民医院检验科 641000)

流感嗜血杆菌是一种无动力的革兰阴性苛养菌，可定植于健康人体上呼吸道表层，致病力较弱，属于人体正常菌群的一部分，当机体免疫力低下时引起人类呼吸道机会性感染，是儿童肺炎、成人社区获得性呼吸道感染的常见病原菌，与卡他莫拉菌和肺炎链球菌并称为“社区获得性肺炎三大病原菌”[1]。除呼吸道感染以外，该菌也可引起血流感染、结膜炎及中耳炎等疾病[2]。本菌体外培养营养要求较高，需使用含有Ⅹ因子和Ⅴ因子的巧克力培养基并在5%～10%的CO2环境中才能生长良好，在普通血平板等常规平板上不生长，但能围绕在金黄色葡萄球菌菌落周围生长而产生特殊的“卫星现象”，可用于本菌的初步鉴定。从20世纪70年代以来，氨苄西林一直是抗流感嗜血杆菌感染的首选药物。但随着时间推移，像其他各种细菌一样，流感嗜血杆菌对氨苄西林及其他一些抗菌药物逐渐出现了耐药性，且耐药率不断上升[3]。本研究收集了某院2013-2016年于临床标本中分离到的736株流感嗜血杆菌的病例信息及药敏试验数据进行统计分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集四川省内江市第二人民医院2013年1月1日至2016年12月31日收治入院的下呼吸道感染患者病例资料。纳入标准：(1)出现脓痰或痰液性状改变。(2)肺部影像学显示渗出、阴影等改变。(3)咳嗽、呼吸窘迫等气道刺激表现。出现以上两种或两种以上表现者入选本研究，采集病例痰液标本或肺泡灌洗液标本进行病原微生物检测。共收集到符合条件病例资料27 578例，2013-2016年分别收集到病例资料6 814例、7 186例、6 657例、6 921例；男17 122例，女10 456例，男女比例1.64∶1.00；年龄 1 d至98岁，平均(33.8±22.5)岁；≤7岁儿童13 656例，>7～60岁9 551例，>60岁4 371例。

1.2方法

1.2.1病原菌分离与初筛 肺泡灌洗液及质控合格的痰液标本接种于嗜血型巧克力培养基(CAH)上培养18～24 h，气体条件为含CO2(5.0±0.1)%。根据流感嗜血杆菌标准菌株生长形态挑取光滑湿润似水滴状菌落进行 “卫星试验”，在血平板(BA)上菌落围绕金黄色葡萄球菌生长而在水解酪蛋白平板(MH)上不产生此现象则判定为疑似流感嗜血杆菌，其他生长情况视为非流感嗜血杆菌。以上平板均购自郑州安图，在有效期内使用。标准菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、流感嗜血杆菌(ATCC9007)，均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)。

1.2.2生化鉴定 挑取可疑菌落使用生理盐水调整浊度至2.7～3.3 McF，使用梅里埃VITEK 2 compact鉴定仪、嗜血杆菌及布兰汉菌鉴定卡(NH)上机鉴定，按照标准操作规程及仪器使用说明书操作，鉴定结果为流感嗜血杆菌且概率大于86%认为是流感嗜血杆菌，进行药敏试验。

1.2.3药敏试验 所有流感嗜血杆菌菌株使用梅里埃ATB-HAEMO药敏测试板进行药敏试验，根据CLSI M100S26标准判读结果，使用头孢哨噻吩纸片(购自重庆庞通)检测菌株β-内酰胺酶。该板条有10种抗菌药物可读取结果，分别为氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢克诺、头孢噻肟、利福平、氧氟沙星、氯霉素、四环素及复方磺胺甲噁唑。

1.3统计学处理 使用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义；线性趋势分析采用Armitage趋势检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1流感嗜血杆菌检出率比较 分离到流感嗜血杆菌736株，检出率2.7%(736/27 578)。2013-2016年检出率分别为1.8%(120/6 814)、2.3%(166/7 186)、2.9%(194/6 657)、3.7%(256/6 921)，通过Armitage趋势检验，可以认为流感嗜血杆菌检出率有逐年增高的趋势(χ2=54.605，P<0.05)。≤7岁组分离到610株，检出率4.5%(610/13 656)，菌株构成比82.9%(610/736)，其中≤1岁儿童检出率达到44.6%；>7～60岁组分离率为0.3%(33/9 551)，菌株构成比为4.5%(33/736)；>60岁组分离率为2.1%(93/4 371)，菌株构成比12.6%(93/736)。≤7岁组的菌株分离率明显高于>7～60岁组及>60岁，且>60岁组的分离率高于>7～60岁组(P<0.01)。男性患者共分离到469株流感嗜血杆菌，女性患者分离到267株，检出率分别为2.7%(469/17 122)及2.6%(267/10 456)，差异无统计学意义(χ2=0.861,P=0.353)。见表1。

表1 流感嗜血杆菌在不同年龄人群的检出数(n)

2.2流感嗜血杆菌对抗菌药物的敏感率比较 本研究统计了流感嗜血杆菌对10种抗菌药物的敏感情况，对复方磺胺甲噁唑、氨苄西林和头孢克诺的敏感率较低，在30%左右，且这3种药物敏感率差异无统计学意义(χ2=4.387，P=0.112)。该菌对头孢呋辛敏感率不足50%，对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟、四环素、氧氟沙星的敏感率差异较小，均在80%～90%，且阿莫西林/克拉维酸与头孢噻肟的敏感率差异无统计学意义(χ2=0.005，P=0.942)，二者用于治疗时有效率相近；对氯霉素、利福平的敏感率高于90%。见表2。

2.3β-内酰胺酶检测结果 使用显色头孢硝噻吩法检测出流感嗜血杆菌β-内酰胺酶产酶率为45.7%(336/736)，其中2013年该菌β-内酰胺酶产酶率为40.8%(49/120)，2014年为44.6%(74/166)，2015年为45.4%(88/194),2016年为48.8%(125/256)，2016年相比2013年产酶株分离略有增加，但差异无统计学意义(χ2=2.101，P=0.147)；同时，对该菌历年产酶率通过Armitage线性趋势检验，χ2=2.134，P>0.05，流感嗜血杆菌β-内酰胺酶产酶率没有随年份增加而增高的趋势，而是保持相对稳定的比率。

表2 流感嗜血杆菌对抗菌药物的敏感率比较[%(n)]

3 讨 论

流感嗜血杆菌广泛寄居于人类上呼吸道中，常在免疫力低下的人群中引起感染，特别对儿童具有较强的致病能力，可引起急性支气管炎、肺炎、中耳炎等[2]。本研究显示本院≤1岁儿童检出率达到44.6%，≤7岁儿童累积检出率达到82.9%，而>7～60岁人群仅检出4.5%，该菌对儿童及老年人的致病性较高，与国内外相关报道情况相似[2-3]，有文献认为这可能与人群免疫状态有关[4]。另外，我国流感嗜血杆菌多分离自呼吸道感染标本，如痰液、肺泡灌洗液，少量分离自血液、生殖道及脓液[5]，而发达国家多从脑膜炎患者血液、脑脊液标本中分离到该菌[4]，国内外研究存在差异，原因值得进一步分析。

对于该菌的治疗，氨苄西林由于其高效低毒的特点一直是作为首选药物列于相关标准及指南中，然而到目前为止，该菌对氨苄西林的敏感率不断下降，从10年前的接近70%到目前的不足60%，这其中即有产β-内酰胺酶的原因，也有青霉素结合蛋白表达异常的原因[6-7]。不仅如此，随着抗菌药物使用越来越广泛，流感嗜血杆菌对其他常用抗菌药物如复方磺胺类、头孢类抗菌药物也产生了耐药性。研究表明流感嗜血杆菌的耐药机制非常复杂，可通过多种方式对多种抗菌药物产生耐药，如质子介导、外排泵等[8]。本研究发现，该院近4年中流感嗜血杆菌对常用药物的敏感率均呈下降趋势，对氨苄西林和复方磺胺甲噁唑的敏感率均在30%左右，可以认为这两种药物已经不适用于临床经验性治疗。较为常用的第1、2代头孢耐药率均在50%左右，其应用价值也逐年降低。有学者认为这种情况的产生与这些类别的抗菌药物易于获得而容易滥用有关[9]。流感嗜血杆菌对第3代头孢、氧氟沙星、氯霉素、四环素及利福平敏感率较高，但因其对儿童有不良反应而临床应用受限，同时，阿莫西林/克拉维酸显示出高效低毒的优势，这一点目前已被我国儿科感染性疾病专家所认可，目前已被推荐为治疗儿童呼吸道感染的道选药物。产β-内酰胺酶是流感嗜血杆菌主要耐药机制，产酶株不仅对氨苄西林、阿莫西林显示耐药性，而且对其他β-内酰胺类抗菌药物敏感率也较低[9]。相关文献分析显示，目前该菌在国内对氨苄西林和复方磺胺甲噁唑的耐药率均排列前两位，而对四环素、利福平等抗菌药物耐药率均较低[10-11]，说明流感嗜血杆菌耐药率的提高并不只存在于某一地区或某一医院，而是一个全国性的普遍问题。细菌耐药性的产生是一个复杂的多方面因素综合形成的结果，抗菌药物的使用频率、时间及剂量均可能与耐药率的提高有关。

目前一般认为细菌耐药率的提高主要是由于抗菌药物的不规范使用，治疗细菌感染均应该获得病原菌药敏试验数据的支持，减缓细菌耐药性的发展关键在于规范抗菌药物的使用。

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