W ee1蛋白激酶的研究进展

袁会军 刘斌 杨艳丽 范钰 李晶晶

Wee1蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸家族成员之一，在进化上高度保守并大量存在于多种真核生物中，在细胞周期的S期和G2期非常活跃。Wee1最初由Nurse［1］从裂殖酵母细胞中分离出来，由于其可通过抑制细胞分裂控制蛋白2（cell division control protein 2，Cdc2，芽殖酵母中称Cdc28，人类中称CDK1）活性，从而抑制细胞进行有丝分裂致使真核生物细胞体积减小，故将其命名为“Wee”家族。Wee1蛋白激酶是DNA复制、染色体浓缩、组蛋白转录中的关键调控中枢，这些生物学行为异常可导致基因组不稳定，引起恶性肿瘤发生［2］，但在恶性肿瘤中抑制或下调Wee1蛋白激酶的表达，可引发有丝分裂灾难和细胞凋亡，导致肿瘤细胞死亡。本文就Wee1蛋白激酶的研究进展作一综述。

1 Wee1蛋白激酶的结构特点

Wee家族包括Wee1A、Wee1B和Myt1，Wee1A存在于体细胞中；Wee1B存在于胚细胞中；Myt1在体细胞和胚细胞中均表达［3］。人Wee1基因位于11p15.3～p15.1，能转录一个3 kD的mRAN，编码含有647个氨基酸，相对分子质量大小为94 kD［4］。该蛋白激酶包括3个结构域：N端调节域、中心激酶结构域和C端调节域［5］。其mRNA的3'端和5'端各有两种长短不一的非翻译区，3'端序列上有两个磷酸化位点，能被泛素化系统识别和降解，5'端则会影响其半衰期［6］。

在细胞周期间期，Wee1蛋白激酶活性的维持依靠其与14-3-3β蛋白结合及其自身磷酸化；在细胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通过CDK1介导的磷酸化负反馈机制、与14-3-3β蛋白结合及其他磷酸化激酶作用机制下调其活性；在细胞M期，β-TrCP与Wee1蛋白激酶磷酸化位点Ser53和PS121结合，导致Wee1蛋白激酶降解［7］。

2 Wee1蛋白激酶在细胞周期中的作用

细胞周期是指真核细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。真核细胞增殖必须依次经历其准备阶段的间期和有丝分裂期，即前一个细胞周期时相必须在下一个细胞周期时相开始前结束。细胞周期能否正确运行和按序完成细胞周期事件，受控于精准的细胞周期调控机制。细胞周期调控系统的核心成分是细胞周期依赖性蛋白激酶CDKs（cyclin-dependent kinase，CDKs）［8］，为确保细胞周期事件发生的时相性和协同性，CDKs的时相性激活在细胞周期中尤为重要，它主要依赖细胞周期蛋白（cyclins）的特异性或时相性表达、积累和分解。

CDKs与cyclins结合形成的CDKs/Cyclins复合物称为有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor，MPF），其调控细胞周期各个环节的启动与进展，进而控制细胞增生与凋亡，CDKs是MPF的催化亚基，cyclins是MPF的调节亚基。在细胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通过磷酸化CDK1的Tyr15位点，抑制CDK1活性使CDK1/Cyclin B复合物失活，进而抑制细胞周期进入有丝分裂期；在细胞S期，Wee1蛋白激酶作为“染色质合成传感器”，有两个连续的磷酸化事件，一是在整个细胞S期磷酸化CDK1的Tyr15位点，防止细胞进入下一个细胞周期时相，直到DNA复制或修复完成；二是磷酸化组蛋白H2B的Tyr37位点，终止组蛋白合成，在进入有丝分裂期前维持正确的组蛋白与DNA比例［9］。由于DNA合成与组蛋白转录的耦合对染色体形成至关重要，因此这两个过程使Wee1蛋白激酶成为维持染色体完整性的主要调节者。

最近研究［10］表明，Wee1蛋白激酶参与DNA复制的调节和复制叉停滞维持，通过调节CDK2活性，Wee1蛋白激酶磷酸化和失活CDK2/Cyclin E复合物，进而在细胞S期控制和调节DNA复制。在Wee1蛋白激酶缺乏的细胞中增强CDK2活性，可导致复制起始协调性失控、分裂过程中DNA结构异常，引起基因组不稳定。

3 Wee1蛋白激酶在DNA损伤反应中的作用

DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，外界环境和生物体内部的因素可导致DNA分子损伤或改变，如果DNA损伤或遗传信息的改变不能更正，会影响基因组的稳定性。真核细胞依赖复杂的细胞周期检测点和DNA修复系统确保基因组的稳定性，在细胞DNA受到化学性或放射性损伤后，细胞周期检测点被激活，阻止细胞周期进程而使DNA修复。DNA修复途径主要有二个分支：毛细血管扩张性共济失调突变基因（ataxia t elangiectasia-mutatedkinase，ATM）/检查点激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）和ATR（ATM and rad3-related kinase，ATR）/Chk1（checkpoint kinase 1，Chk1）通路，这两条通路存在较多联系。ATM可被电离辐射、放疗和引起DNA双链损伤的药物激活，ATM可磷酸化和激活Chk2，Cdc25c磷酸酶的Ser216位点，生成一个能与14-3-3δ蛋白结合的位点封闭Cdc25c磷酸酶出入细胞核与细胞质的进出口，有效灭活Cdc25c磷酸酶活性，使CDK1处于无功能状态，CDK1/Cyclin B复合物亦无活性，细胞周期便不能进入有丝分裂期［11］。ATR可被广泛的基因毒性刺激，进而导致DNA单链断裂而激活［12］。此外，ATR可依赖ATM激活而激活，发生在双链DNA断裂的过程中［13］，ATR是负责磷酸化、激活Chk1的主要激酶，与Chk2相比，Chk1能被ATM和ATR同时激活，可发生在正常的细胞周期过程中或在响应细胞复制压力时（比如在复制叉停滞期），Chk1可同时磷酸化、激活Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶，Wee1蛋白激酶磷酸化CDK1/Cyclin B复合物CDK1的Tyr15位点，使其失活，结果使细胞周期阻止在G2期，进行DNA修复。Cdc25c磷酸酶可去磷酸化作用CDK1的Tyr15位点，使其恢复活性，结果使细胞周期进入M期。可见细胞周期能否进入M期，取决于Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶的平衡状态。

4 Wee1蛋白激酶与肿瘤

4.1 Wee1蛋白激酶与肿瘤的相关性

恶性肿瘤最基本的生物学特征是肿瘤细胞失控性增生，涉及细胞周期调控机制及DNA损伤修复的细胞传导通路改变。有研究指出，M期细胞周期蛋白与肿瘤关系密切，其中CDK1/Cyclin B磷酸化调节机制缺陷与肿瘤的发生发展有关［14-15］。p53基因主要在G1/S期对DNA损伤点进行检查，监控基因组的完整性，但多数肿瘤细胞中p53基因缺失，导致细胞周期G1检查点缺陷，故在DNA复制及损伤修复过程中更加依赖于G2/M检查点，促进Wee1蛋白激酶大量表达，使CDK1/Cyclin B复合物不能被激活，间接引起Cyclin B过度积聚，从而促进肿瘤发生。当降低Wee1蛋白含量时，可引起Fasligand诱导的细胞凋亡，同时产生CDK1的Caspase依赖性激活［16］。

Wee1蛋白激酶作为重要的调节因子，在DNA复制、组蛋白合成和染色体浓缩等过程中起重要调节作用，这些过程的不稳定都会使染色体的完整、遗传和表观遗传信息传递受影响，导致肿瘤发生。Wee1基因缺失或表达抑制后，可导致细胞周期相关激酶活性上调，进一步导致DNA损伤、细胞有丝分裂灾难和细胞凋亡事件发生。可见，Wee1蛋白激酶既是肿瘤发生的原因，又是肿瘤治疗的潜在靶点。

4.2 Wee1蛋白激酶与肿瘤治疗

研究表明，Wee1蛋白激酶在多种恶性肿瘤中过表达，如胰腺癌［17］、恶性黑色素瘤［18］和恶性胶质瘤［19］等，其高表达与无病生存率相关［20］。抑制Wee1蛋白激酶表达可致G2检测点废除，允许细胞周期携带未修复的DNA进入有丝分裂期，引发有丝分裂灾难，最终导致细胞死亡。合成致死（synthetic lethality）是指两个或多个非致死基因同时失活导致细胞死亡的现象［21］，如果肿瘤中存在特定基因失活，用药物抑制其合成致死搭档，可特异性杀死癌细胞，且不损害正常细胞。由于p53基因在肿瘤中缺失普遍，因此对于p53缺失的肿瘤，利用Wee1抑制剂可取得更好的效果［22］。此外，Wee1抑制剂与Chk1抑制剂具有协同效应，能更好地杀死肿瘤细胞［23］。

4.3 Wee1抑制剂的临床应用

Wee1抑制剂有AZD-1775、PD0166285和PD0407824。PD0166285可同时抑制Wee1和Myt1；PD0407824是Wee1和Chk1的共同抑制剂；AZD1775是Wee1的特异性小分子抑制剂。此外，miR-194对Wee1亦有抑制作用。目前研究最多的是AZD-1775，其已进入Ⅱ期临床试验，被用于Wee1高表达的肿瘤，其耐受性良好，不良反应较少。

HepG2/DDP细胞系是被敲除Wee1基因的肝癌细胞，Wee1蛋白激酶被沉默，可导致HepG2/DDP细胞系对顺铂的敏感性增强，同时也增加细胞凋亡的速度；GST、MRP1、LRP、BCL-2、Pgp、Survivin等蛋白表达水平在HepG2/DDP细胞系中明显减少，MEK/ERK的磷酸化水平也显著降低，说明Wee1可调节药物相关基因的表达及MEK/ERK通路活性，从而控制人类肝癌细胞的耐药性及增殖［24］。有研究显示，Wee1在结直肠癌肝转移中作为分支血管的推动者，在肿瘤的生长和发展中起重要作用，AZD-1775可减少肿瘤血管形成的范围而不依赖于对肿瘤细胞的影响；在对比转移病灶内的血管内皮细胞与正常肝组织相邻的血管内皮细胞时发现，内皮细胞形态上相似，但其分子表达不同［25］。在对Ⅳ期胃癌患者和伴淋巴结转移的男性胃癌患者研究中，Wee1蛋白激酶具有较高的表达水平且其存活率较低；对胃癌细胞系（AGS、YCC-2、MKN28、KATOⅢ、SNU-1、SNU-5、SNU-16、SNU-216、SNU-601、SNU-638、SNU-668和SNU-719）的研究显示，AZD-1775可显著抑制胃癌细胞增殖、诱发细胞凋亡和细胞周期停滞，在Wee1高表达的胃癌细胞株中更有效，Wee1抑制剂联合其他抗癌药物（5-FU、紫杉醇等）较单独应用更有效［26］。胰腺导管腺癌细胞系中，AZD-1775的抗肿瘤效果受DNA修复状态影响，在DDR-P（DNA repair proficient）细胞系（MIA PaCa2和PANC-1）中的效果优于含DNA修复基因（FANCC、FANCG和BRCA2）突变的细胞系（PL11、Hs 766T和Capan-1），单独抑制Wee1可能无法提供临床帮助，特别是FANCC、FANCG和BRCA2基因突变者［27］。三阴性乳腺癌的研究表明，顺铂治疗诱导DNA损伤可激活DNA复制检测点ATR、Chk1、Wee1调节，使细胞周期阻滞在S期以便DNA修复，阻止了顺铂引起的细胞死亡而产生耐药。利用Wee1抑制剂或siRNA可引起DNA复制再燃，进一步增加复制压力和导致更多的DNA损害，最终使癌细胞死亡，同时使用顺铂和AZD-1775抑制剂治疗三阴性乳腺癌，有望克服顺铂耐药性并取得更好的治疗效果［28］。miR-194表达在喉鳞状细胞癌组织和细胞中显著下调，在喉鳞状细胞癌细胞中miR-194过表达能抑制肿瘤增殖、转移、浸润和耐药，而Wee1被证明是miR-194新的直接作用靶点，其过表达在一定程度上克服了miR-194抑制肿瘤的效果［29］。以上研究表明，Wee1抑制剂可降低肿瘤细胞耐药性，抑制肿瘤生长及转移，Wee1高表达者采用Wee1抑制剂与其他抗肿瘤药物联合应用抗肿瘤效果更佳，但其效果取决于DNA的修复状态。

5小结

综上所述，Wee1蛋白激酶在细胞周期S期和G2/M过渡期有重要作用，如在细胞DNA损伤时，可使细胞周期停滞以便受损的DNA修复。在多种肿瘤中由于Wee1蛋白激酶处于过表达状态，抑制或下调Wee1蛋白激酶可引起有丝分裂灾难，导致细胞凋亡，因此，Wee1蛋白激酶可能是理想的肿瘤治疗靶点。Wee1蛋白激酶抑制剂AZD-1775联合其他抗肿瘤药物可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，取得更好的疗效。虽然Wee1蛋白激酶在肿瘤发生发展过程中的确切作用机制尚未完全明了，但现有的研究结果为抗癌治疗带来了新的希望。

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