MSCs共培养抗ARPE-19细胞氧化应激的作用研究

柴 勇 焦守峰*

（1 江西省儿童医院，江西 南昌330000；2 南昌大学第三附属医院，江西 南昌330000）

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是近年来中国老年人群中视力损伤的主要原因[1]。尽管其具体发病机制尚未完全明确，大量研究表明氧化应激在其发生发展中有重要作用。研究发现，随着年龄增加RPE细胞对氧化应激变得更加敏感，因此减轻视网膜上皮细胞氧化应激损伤可能是预防AMD的新思路[2]。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种重要的免疫调节细胞，其调节作用效果在多种自身免疫性疾病、糖尿病以及角膜烧伤、干燥症等疾病中已被证实[3]，而AMD发病机制恰是免疫紊乱、过氧化损伤等密切相关。因此，我们推测MSCs共培养可抗ARPE-19细胞氧化应激从而减轻AMD病变，可能成为AMD细胞治疗的新思路，且关于该方面的研究尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 主要材料：ARPE-19 cells购自美国ATCC公司；DMEM/F-12培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；CO2细胞培养箱购自日本SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组：常规培养ARPE-19细胞与MSCs细胞，随机分为正常组、H2O2组和共培养组：正常组常规培养；H2O2组利用200 μmol/L浓度的H2O2刺激干预构建氧化应激模型，共培养组在MSCs与ARPE-19细胞于Transwell共培养的基础上给予H2O2氧化应激干预。

1.2.2 细胞共培养：培养第3代MSCs与ARPE-19至对数期，用胰酶消化重悬计数后接种MSCs于Transwell下室，上室内接种ARPE-19，使上下室的培养液相互通融，从而建立起共培养体系，72 h终止培养并行相应分析。

1.2.3 比色法测定细胞SOD活性和GSH-Px、MDA水平：ARPE-19细胞分组处理后胰酶消化收集细胞，接种六孔板常规培养至70%，根据试剂盒对细胞氧化应激指标水平进行测试。

1.3 数据处理：利用SPSS22.0软件进行统计学分析处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MSCs共培养对ARPE-19细胞SOD活性的影响：H2O2预处理可明显降低ARPE-19细胞内SOD活性，与对照组比差异具有显著性差异（P＜0.05）；而MSCs共培养可显著提高H2O2预处理后ARPE-19细胞内SOD活性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 MSCs共培养对ARPE-19细胞GSH-Px水平的影响：H2O2预处理可明显降低ARPE-19细胞内GSH-Px水平，与对照组比差异具有显著性差异（P＜0.05）；而MSCs共培养可显著提高H2O2预处理后ARPE-19细胞内GSH-Px水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 MSCs共培养对ARPE-19细胞MDA水平的影响：H2O2预处理可显著提高ARPE-19细胞内MDA水平，与对照组比差异具有显著性差异（P＜0.05）；而MSCs共培养可逆转H2O2预处理ARPE-19细胞内MDA水平变化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

以上结果提示H2O2刺激能诱导ARPE-19细胞内氧化应激损伤，而MSCs共培养能通过抗氧化应激发挥保护作用。见表1和图1。

3 讨 论

年龄相关性黄斑变性（AMD）是引发老年人视力缺损的常见原因，其发病机制尚无定论。研究表明，氧化应激在AMD发生发展机制中有重要作用；且抗氧化物能显著减缓AMD的发病进程。因此，有效的改善RPE细胞抗氧化应激可能是防治AMD进展的新策略。

大量研究表示，AMD与补体系统突变、慢性炎症及氧化应激等因素密切相关[4]。生理条件下体内氧化-抗氧化系统处于动态平衡中；当机体处在病理条件时平衡被破坏，体内自由基能导致脉络膜微血管及RPE细胞的损伤，进而加剧视网膜发生黄斑变性[5]。

表1 各组ARPE-19细胞内氧化应激水平比较（±s）

表1 各组ARPE-19细胞内氧化应激水平比较（±s）

注：与CON比，*P＜0.05；与H2O2组比，#P＜0.05

组别 SOD(U/mL)GSH-Px(mg/gport)MDA(nmol/mL)对照组(CON) 16.61±0.32 29.76±0.74 1.38±0.27 H2O2模型组(H2O2) 9.83±0.71* 20.19±0.83* 3.24±0.41*共培养组(MSCs) 14.49±1.29# 26.52±0.91# 2.16±0.62#

图1 各组ARPE-19细胞内氧化应激水平比较（与CON比，*P＜0.05；与H2O2组比，#P＜0.05）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种重要的免疫调节细胞，在刺激后对免疫系统表现出很强的调节作用，在多种自身免疫性疾病、角膜烧伤等疾病中已被证实；而AMD发病机制则与免疫紊乱、过氧化损伤等密切相关，这些使MSC极有可能成为细胞治疗的良好选择之一[6]。SOD与GSH-Px有清除ROS作用，在ARPE-19细胞抗氧化应激损伤过程中有重要作用；MDA 是细胞膜脂质过氧化产物，能反应细胞内脂质过氧化的程度。本研究显示：利用H2O2干预刺激后，细胞内SOD活性和GSH-Px显著降低，MDA水平显著增高，提示ARPE-19细胞发生显著的氧化应激反应；而利用MSCs共培养能显著逆转H2O2诱发的氧化应激，有明显的抗氧化应激作用。综上所述，MSCs共培养能显著提高ARPE-19细胞抗H2O2诱导的氧化应激作用，但其具体作用机制有待我们深入研究。

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[2] 潘俊如,余其林,张述,等.老年性黄斑变性病因研究新进展[J].国际眼科杂志,2013,13(5):905-908.

[3] 荻屋道雄,今川究,细田勇喜,等.含有间充质干细胞的条件培养基的角膜内皮细胞培养用培养基[P].2015-05-27.

[4] Ayaz L,Dinc E.Evaluation of microRNA responses in ARPE-19 cells against the oxidative stress[J].Cutan Ocul Toxicol,2017:1-6.

[5] 俞永珍,邹秀兰,邹玉平.氧化应激及抗氧化物在年龄相关性黄斑变性中的作用[J].眼科新进展,2015,35(5):489-492.

[6] 邓君,陈晓,晏颖,等.诱导多功能干细胞在视网膜疾病中的应用[J].中国组织工程研究,2013,17(36):6533-6540.