神经干细胞侧脑室内移植对脑瘫鼠的治疗效果

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脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)简称脑瘫，是一种非进行性脑损伤所致的，以姿势异常和运动障碍为主要表现的综合征，多在小儿出生前至出生后1个月内发生，常合并有感知觉障碍、智力障碍等症状[1]。CP不仅对患儿的生长发育及日后生活带来巨大影响，而且给患儿家庭带来沉重的负担。目前临床上尚无确切治疗脑瘫的方法，也无有效药物，只能依靠综合治疗方法进行早期康复治疗[2]。干细胞移植技术及基因临床治疗技术日新月异的发展，为CP患儿的治疗康复提供了新途径[3]。为了探讨干细胞移植是否对CP的治疗有效，本研究采用改良的HIE手术方法对Wistar大鼠进行脑瘫建模，建模后行侧脑室内神经干细胞(NSCs)移植治疗，并对模型组、对照组及实验组大鼠神经行为学检测结果、Morris水迷宫逃避潜伏时间以及脑室旁白质中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的含量进行对比分析，以探究侧脑室内NSCs移植对脑瘫鼠模型的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取60只7日龄健康、SPF级Wistar大鼠，体重13 g～15 g，均喂养于自由进食、进水，相对湿度45%～60%，室温23℃～25℃，光照12 h的环境中；大鼠购买自新疆医科大学实验动物中心，许可证编号：SYXK(新)2015-0004。

1.2 药品与仪器 侧脑室神经干细胞由本实验室自行配置[4]；兔抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)由汉博士德生物工程有限公司提供；生物显微镜BX50F4，由日本OLYPUS公司提供。

1.3 动物分组与建模 建模方法：除对照组外，对48只大鼠行改良HIE造模方法。所有大鼠麻醉后，固定在手术板上，颈前正中作切口，分离并结扎左颈总动脉，然后缝合切口；将大鼠置于37℃的水封闭缺氧箱中，氧气含量为8%，维持2 h；对建模后的大鼠，参考Hideyuki[5]的方法进行神经行为学及病理学检查，选取24只建模成功大鼠。 对照组假手术后，给予等量生理盐水。 模型组造模后回笼饲养，给予等量生理盐水。 NSCs组(实验组)建模3 d后给予NSCs移植。

1.4 治疗方法 实验组大鼠建模3 d后，麻醉并进行颅骨钻孔。将大鼠置于立体定向仪头架上，进行左侧脑室穿刺，微量泵缓慢注入2 μLNSCs移植液。注射后留针2 min，采用骨蜡将注射针孔封闭，缝合头皮。

1.5 病理组织观察 心脏灌注后，进行断头取脑，采用4%多聚甲醛溶液进行固定。24 h后，在脑前卤取冠状脑组织约1 mm，作石蜡切片。经HE染色后，固定、晾干，光镜下观察。

1.6 观察指标及评估方法 对比各组大鼠在42日龄时的Morris水迷宫溺水逃避潜伏期时间差异，Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年(1981)代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段。将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)。采用悬吊实验(大鼠前腿抓住粗0.5 cm的玻璃棒，观察其掉下的时间，<10 s得1分；10 s～30 s得2分；31 s～119 s得3分；2 min～5 min得4分；>5 min得5分)、斜坡实验(大鼠放置于坡度为45°的斜坡上，观察大鼠调转头的时间)、旷场实验(长宽高分别为36 cm的无盖方盒，盒底划分成9个等大小的格子，观察记录大鼠活动情况，大鼠1/2以上身体部位进入相邻方格计为1分，大鼠后肢性站立得1分，二者相加为其总分)，评定各组大鼠的神经行为能力。

对比各组大鼠的脑室旁白质中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量差异。免疫组化法检测GFAP含量。断头取脑后制作石蜡切片；切片脱蜡脱水，微波抗原修复约20 min，3%H2O2室温孵育10 min，BSA室温封闭10 min，兔抗大鼠GFAP抗体处理4℃过夜。二抗37℃下孵育20 min，SABC试剂于37℃下孵育20 min。HE染色，经脱水、透明后采用中性树脂封片。晾干、待检。400倍镜下每张切片同一部位随机选取5个不同的视野，采用数码相机图像采集系统采图。Imageproplus6.0软件对图像进行分析，免疫组化检测测量阳性细胞数，求其平均数作为最后的阳性结果，并记录阳性细胞数。

2 结 果

2.1 病理切片结果分析 正常组大鼠脑室周围组织中细胞排列规则，未发现炎症细胞、软化灶形成(见图1A)；模型组大鼠的脑室周围组织中可见细胞排列紊乱，细胞出现变性、肿胀、坏死，炎症细胞浸润增加，软化灶形成(见图1B)；NSCs组的病理严重程度较模型组显著的减轻(见图1C)。

注：A为正常组，B为模型组，C为NSCs组(100倍)。

图1 HE染色观察

2.2 各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏时间比较 42日龄时，模型组大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏时间显著长于NSCs组和正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)；NSCs组大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏时间显著长于正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.3 各组大鼠神经行为能力测定 42日龄时，模型组大鼠的斜坡实验时间显著长于NSCs组和正常组大鼠，悬吊试验和旷场试验评分显著低于NSCs组和正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)；NSCs组大鼠的斜坡实验时间显著长于正常组大鼠，悬吊试验和旷场试验评分显著的低于正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别n悬吊试验(分)斜坡实验(s)旷场实验(分)正常组 123．86±0．722．11±0．3713．61±2．85模型组 12 2．21±0．531)2) 4．20±0．561)2) 7．20±2．231)2)NSCs组123．18±0．671)2．95±0．421)10．42±2．501)F值8．41714．00315．928P0．037<0．001<0．001 与正常组比较，1)P<0．05，与NSCs组比较2)P<0．05。

2.4 各组大鼠脑室旁白质中GFAP阳性细胞计数 42日龄时，模型组大鼠的脑室旁白质中GFAP阳性细胞数目显著高于NSCs组和正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)；NSCs组大鼠的脑室旁白质中GFAP阳性细胞数显著高于正常组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图2。

组别nGFAP阳性细胞数(%)F值P正常组1241．3±3．2模型组1262．0±4．715．582<0．001NSCs组1247．8±4．5

注：A为正常组，B为模型组，C为NSCs组(200倍)。

3 讨 论

随着医疗技术的发展，脑性瘫痪患儿的生存率逐年上升，脑性瘫痪患儿的治疗康复方法亦成为临床研究的重点。脑性瘫痪发病机制尚不明确，其发生与围生期多因素相关，如早产、低体重、产时窒息、感染、多胎以及脑室周白质软化等均为脑性瘫痪的常见危险因素[6-7]。神经干细胞具有多向分化及自我更新的能力，能够促进损伤脑组织再生，维持神经内环境稳定，近年来外源性NSCs治疗脑损伤已成为临床研究热点[8-11]。为探讨侧脑室内神经干细胞移植对小儿脑瘫的治疗效果，本研究对7日龄大鼠进行脑瘫造模并采用侧脑室内神经干细胞移植治疗。

3组病理组织观察：正常组大鼠脑室周围组织中细胞排列规则，未发现炎症细胞、软化灶形成；模型组大鼠的脑室周围组织中可见细胞排列紊乱，细胞出现变性、肿胀、坏死，炎症细胞浸润增加，软化灶形成；NSCs组的病理严重程度较模型组显著减轻。说明神经干细胞干预治疗能够减轻损伤部位炎性反应，减缓炎症浸润，保护脑室周围组织细胞。

3.1 NSCs移植对脑瘫鼠Morris水迷宫逃避潜伏时间的影响 Morris水迷宫实验具有视频摄像跟踪技术，能够避免人为干扰，结果真实可靠，被广泛用于动物的空间学习记忆能力的研究。本研究采用Morris水迷宫对3组大鼠学习记忆能力进行检测，结果显示：42日龄时，模型组大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏时间显著长于NSCs组和正常组大鼠；NSCs组大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏时间显著长于正常组大鼠。说明NSCs移植能够改善脑瘫鼠的智力水平，提升空间学习记忆能力，对脑瘫鼠治疗具有积极意义。

3.2 NSCs移植对脑瘫鼠神经行为能力的影响 42日龄时，模型组大鼠的斜坡实验时间显著长于NSCs组和正常组大鼠，悬吊试验和旷场试验评分显著低于NSCs组和正常组大鼠；NSCs组大鼠的斜坡实验时间显著长于正常组大鼠，悬吊试验和旷场试验评分显著低于正常组大鼠。NSCs组的神经行为能力明显高于模型组，说明NSCs移植干预治疗后脑瘫鼠的神经行为能力得到提升。

3.3 NSCs移植对脑瘫鼠脑室旁白质中GFAP阳性细胞数量的影响 星形胶质细胞(AS)是中枢神经系统的主要细胞之一，具有维持神经细胞微环境稳定以及调节代谢过程的作用，胶质纤维酸性蛋白(glial fibillary acidic protein GFAP)是AS中间纤维所特有一种细胞骨架蛋白，可作为AS的特征性标记物[12-13]。本研究通过对3组大鼠脑室旁白质中GFAP阳性细胞数量的检测，结果显示：42日龄时，模型组大鼠的脑室旁白质中GFAP阳性细胞数目显著高于NSCs组和正常组大鼠；NSCs组大鼠的脑室旁白质中GFAP阳性细胞数显著高于正常组大鼠。星形胶质细胞具有保护及抑制神经元的双重作用：神经损伤后AS激活，产生神经营养因子及大量GFAP用于损伤修复；大量GFAP堆积以及AS过度胶质化，可形成机械阻断屏障，影响髓壳等的再生。本研究中NSCs组大鼠GFAP数量大于对照组，说明AS激活，机体修复神经损伤，但其数量小于模型组，可以减少AS细胞过度胶质造成的负面作用。

脑瘫鼠模型采用侧脑室内NSCs移植治疗，能够显著的改善其神经行为及学习能力，值得临床对此方法进一步研究使用。

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