维甲酸信号通路与先天性脊柱侧凸体节发育的研究进展

陈崇 李政 陈峰沈 建雄

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，协和转化医学中心，北京 100730）

先天性脊柱侧凸（congenital scoliosis,CS）为胚胎期中轴骨发育异常所致的脊柱畸形，新生儿发病率约0.5‰～1‰[1,2]，常合并肋骨畸形[3]、椎管内畸形[4,5]、心肺功能障碍[6]等多个系统畸形[7]，常给临床诊疗工作带来极大挑战[8]。其致病机制尚未明确，而孕期环境因素与椎体畸形存在一定联系[9]。

维生素A是一种脂溶性维生素及其包括维甲酸（retinoic acid,RA）在内的衍生活性代谢产物，为机体生物功能所必需，在维持正常视力、胚胎发育、生殖、细胞分化、免疫功能和生长发育等方面发挥重要作用。RA的剂量效应具有双面性，一方面，就体节形成及胚胎发育而言是必要的化学物质之一[10]，另一方面，孕期接触过量RA可致中轴骨异位转化或中轴骨截断等[11,12]。RA受体（RA receptor,RAR）与其配体基因在轴旁中胚层显著表达，对体节形成过程中的分节时钟和HOX基因的表达模式进行调控[13]。然而高浓度RA可干扰神经嵴迁移、器官发育，甚至可以引起轴旁中胚层、脊索和神经管细胞的死亡[14]。

1 孕期维生素 A与胚胎发育

目前认为血浆维生素A≥1.05 μmol/L为正常，0.7～1.05 μmol/L 为 边 缘 缺 乏 ，＜0.7 μmol/L 为 缺乏，＜0.35 μmol/L为严重缺乏[15]。纵观全球，仍有近700万孕妇和学龄前期儿童遭受维生素A缺乏的危害，我国孕妇维生素A摄入量远低于推荐摄入量，情况不容乐观[16]。

妊娠期妇女血浆维生素A水平不但影响孕妇本身的营养状况，对胎儿发育的影响更为重要[17]。其中子宫高度、新生儿出生体重、身长与胎龄、孕妇产前血清维生素A水平呈正相关[18]。

孕激素可促进肝脏和脂肪组织中储存的维生素A释放进入血液，由于妊娠早期孕激素水平较低，维生素A较低可能与孕激素水平相对较低有关。此外，孕早期呕吐等妊娠反应，也可导致维生素A的摄入不足[19]。

孕早期维生素A摄入不足会直接影响胎儿发育，导致一系列先天畸形，包括心脏（室间隔缺损、海绵状心肌、主动脉弓缺陷、动脉导管未闭）、泌尿生殖系统（异位卵巢、假两性畸形、肾脏畸形）、中枢神经系统（脑水肿、脊柱裂）等，甚至死胎[20]。

近年来的研究提示，维生素A代谢产物RA及RA信号通路在调控胚胎体节发育起到重要作用。RA是维生素A的重要代谢活性小分子，在体内由维生素A经连续二步酶促反应合成而来。视黄醛去氢酶（RALDH）参与第二步酶促反应，作为调控RA合成的关键酶，其家族成员包括RALDH1，RALDH2和RALDH3，这些酶的表达具有时空特异性。其中RALDH2主要参与胚胎期前肢、体节和重要内脏器官（心、肺、肾）的形成发育，而RALDH1和RALDH3涉及眼睛和鼻子的形成、发育[21]。体内实验证明，斑马鱼胚胎发育过程中RALDH2基因敲除后RA水平明显下降，引起包括半椎体、楔形椎和蝴蝶椎等严重的脊柱畸形[22]。Li等[23]研究发现大鼠孕期外源性维生素A缺乏条件下，可观察到子代多种先天性骨骼畸形，发生率约 13%，同时 RALDH1，RALDH2和RALDH3及RAR α、β、γ基因表达显著下调，提示孕期维生素A缺乏或不足可直接导致CS的发生、发展。

2 RA信号通路

RA可直接与细胞核内的RA受体结合，激活核内受体或靶基因而发挥生物学效应。RA受体发现已久，属于核受体配体激活转录调节因子超家族，对其分子水平效应多样性的认识循序渐进[24,25]。研究报道，全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）通过抑制Runx2对C/EBPβ的转录而促进成骨分化[26]，也可通过抑制C/EBPβ的转录活性下调PPARγ的转录活性，抑制脂肪细胞分化，间接促进脂肪干细胞的成骨分化[27]。

RA信号通路调节靶基因的方式复杂多样。第一级复杂性体现在RA的存在形式，包括全反式维甲酸、3-4双脱氢全反式维甲酸、9-顺式维甲酸等；第二级复杂性体现在与细胞质内RA结合蛋白CRABP I或CRABP II结合后在细胞内进行转运，其中CRABP I将胞质内的RA转移至内质网，而CRABP II与细胞质内未被代谢的RA结合转运至核内，作为核受体（RXR或RAR）的配体，进而发挥生物效应；第三级复杂性体现在RA信号通路生物功能可通过膜受体与核受体协同进行。此外，RA核受体可与多种转录因子（辅助活化因子或辅助抑制因子）相作用，更增加了该信号通路分子基础的多样化。

任意一种RXR或RXR异构体均包含2个高效协同转录激活的功能域，即AF-1（配体非依赖区）和AF-2（配体依赖区）。其中，AF-1的研究中，转录因子TFIIH结合的CDK77可选择性磷酸化RARα的77号丝氨酸（Ser-77），而具体机制不详[28]。AF-2的功能类似于辅助活化蛋白，在核受体及转录因子间搭起桥梁[29]。

RAR α、β、γ在神经嵴的颅面部起源区均有表达，RAR α和RAR β集中在前、中、后脑和脊神经中广泛表达，RAR β更多集中于后脑和脊神经，RAR γ集中在纹状体、脑垂体表达。值得注意的是，RAR β2和RAR γ在体节、骨骼、软骨组织中高度表达[30]，体现了胚胎发育期不同成体组织间的时空特异性，表明RARs和RXRs不同亚类及异构体具有独特的功能[31]。

RA信号通路的功能最终依赖于基因转录的调控来实现，体内多种激素、激酶及转录因子都受到RA信号通路的调节。其中主要分为两种作用机制，即RA直接与间接调控靶基因。直接调控机制中，靶基因启动子区包含了RA的反应元件RARE，而更多的生物效应则是通过间接调控完成。RA及其受体与细胞因子功能类似，可作为细胞内或细胞间的通讯信号，同时，其分子功能又非常依赖于细胞内环境，借助于同源二聚体（RXR-RXR）、异源二聚体（RXR-RAR）或RXR其它核受体异源二聚体与多种信号通路间发生交互作用（Cross-talk）。不可忽视的是，多个信号通路见到交互作用，增加了体节发育调控的复杂性与精密性。

3 孕期环境因素与先天性脊柱侧凸

CS临床上可分为三型：I型（形成障碍型），表现为一个或多个椎体部分或完全的形成障碍，如半椎体、楔形椎和蝴蝶椎等；II型（分节不良型），表现为两个及以上椎体部分或完全分节不良，如融合椎、阻滞椎；III型（混合型），同时存在I型和II型的畸形特征。

其中孕期环境因素与CS发病密切相关，尤其在孕早期不良环境因素的暴露，可导致椎体畸形，而CS的临床分型特征与孕期环境因素间的联系未见明确报道[32]。除维生素A和维甲酸外，目前已发现的相对确切的环境因素包括以下几个方面：①丙戊酸，女性妊娠期服用丙戊酸（valproic acid,VPA）可明显增加胎儿脊柱裂、神经管畸形的发生率，具体机制可与Pax-1和Paraxis两个模式基因的表达下调有关[33,34]；②低氧，胚胎发育早期的一过性低氧，可产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。由于神经管和体节中胚层细胞代谢活跃，大量ROS可造成导中轴骨发育缺陷[35]；③一氧化碳(carbon monoxide，CO)，妊娠期吸烟妇女，在器官形成早期CO可作为一种信号分子抑制Pax-l和Paraxis基因的表达，导致神经管和轴旁中胚层发育异常[36]；④砷，砷作为重要的化工产物，孕期接触可以导致多种出生缺陷，包括发育迟滞、高死亡率、低体重儿、额面缺陷、脊柱裂和神经管发育异常等[37]；⑤糖尿病，妊娠期糖尿病患者，患儿远端中轴骨缺陷和尾骨退化综合征的发生率比正常者高约200倍[38]，可能是高糖环境增加了神经管和其他器官中ROS产物的浓度，抑制Pax-3基因表达，导致脊索发育关键基因Shh和Brachyury功能紊乱[39,40]或直接造成细胞死亡[41]。⑥乙醇，乙醇可改变胎盘血管结构间接性引起胚胎宫内缺氧，同时也可通过血胎屏障直接引起胚胎细胞死亡[42]；⑦高温，持续超过正常温度2°C，胚胎脊柱、神经管发育畸形、心脏缺陷、小眼等畸形发生率增加，主要与热休克蛋白产生机制有关[43]。

4 体节发育与RA信号通路

体节起源于前体节中胚层（pre-somitic mesoderm,PSM），是胚胎发育过程中形成的规律分节的结构。其沿体轴两侧从前向后有序形成生皮节、生肌节和生骨节，继而衍生出真皮、骨骼肌和中轴骨，其中中轴骨日后将发育为椎体，体节生成异常将直接导致椎体发育异常[44]。体节发育的分节时钟及前向波模型最早由Cooke等于1976年报道[45]。体节的周期性生成与前体节中胚层中同步基因表达的振荡模式密切相关，这种基因表达的模式即分节时钟[46]。

这种模型受到Wnt、Fgf和Notch等信号通路的共同调节。这些通路中的基因形成一个周期性表达的沿前体节中胚层传递的表达波谱，共同影响体节的延长和分节[47,48]。利用斑马鱼模型，可观察delta C在体节形成中的表达，进一步证明了分节时钟-前向波模型的确切性以及Notch信号通路在体节发育中的作用[49]。也有学者认为体节并非完全依赖分节时钟-前向波模型，而是依靠体节细胞间的相互作用[50]。

脊椎动物的胚胎往往遵循严格的双侧对称发育，从而产生诸如椎骨和骨骼肌等重复的身体结构。椎体分节由一个循环基因表达系统调控，即分节时钟，其中Delta-Notch信号通路和其靶基因在PSM的表达，产生双侧对称的分子振荡[51]。体节形成的边界区域是由该振荡器的相互作用控制的，主要由Fgf和RA信号通路相反的梯度信号构成。RA信号通路在体节形成的作用与Wnt和BMP等信号通路的联系日益受到更多学者的关注[52]。研究表明，RA信号通路的缺失会导致循环基因表达系统的不对称性，但是RA信号通路和振荡器之间的联系尚未可知。体节形成过程中，Notch信号通路及靶基因依赖转录因子Su(H)（Suppressor of Hairless）调控，而RA的降解酶cyp26a1同样依赖Su(H)的调控活性。因此，斑马鱼尾芽中多余的RA可能导致循环基因表达系统（振荡器）的不对称性。这表明Notch信号通路的关键转录因子可影响RA的代谢，且通过影响体节形成导致尾芽发育的不对称性[53]，而体节的形成又需要RA和它的辅助活化剂包括Wdr5、Hdac1、Hdac2，Rere和组蛋白甲基转移酶Ehmt2的蛋白质复合体的协同作用[54]。

曾经有报道认为RA通过RARE调控元件直接抑制Fgf8的表达从而影响体节发育[55]。Wnt8a和Wnt3a在体节形成的尾芽出存在协同促进Fgf8的表达，从而促进哺乳动物身体的中轴延长，对Wnt-Fgf-RA信号通路的相互调控，提出了新观点，从单一信号通路到多个信号通路协同调控[56]。玻璃海鞘脊索及轴旁中胚层的研究[57]提示，RA-Fgf/MAPK及Wnt通路在躯干的生长方面存在协同调控机制。不难看出，RA信号通路与Wnt、Notch、Fgf、MAPK及BMP信号通路间的精密配合说明了重复组合信号如何进行体节发育调控制和随后特定的功能与分化。

5 小结与展望

目前我国维生素A的流行病学研究多源于散在小样本人群，未来如何开展覆盖全国城乡居民的监测体系，详细评估居民维生素A营养状况，建立可靠的流行病学信息数据库，并逐步消除维生素A缺乏这一公共卫生问题，预防先天畸形发生，关乎国计民生。

对于维甲酸信号通路在先天性脊柱侧凸体节发育的研究中，关注分子表层功能较多，具体分子机制的研究相对较少。由于研究检测指标的瞬时性，多以静态的观察为出发点，如何将体节发育中动态的时空变化进行详细阐述，是未来的学者们思考的方向之一。此外，CS的临床分型特征与孕期环境因素间的联系，也值得学者们进行深入研究。

在维甲酸信号通路调控体节发育的过程中，将表观遗传学、遗传学及结构生物学的观点纳入发育学研究领域中，是未来挖掘先天性脊柱畸形的切入点。同时联合应用不同组学的分析模式以及单细胞测序技术，更为精准的研究致病机制，以期为临床的诊疗工作服务[58]。

[1]McMaster MJ,Ohtsuka K.The natural history of congenital scoliosis.A study of two hundred and fifty-one patients.J Bone Joint SurgAm,1982,64(8):1128-1147.

[2]Shands AR Jr,Eisberg HB.The incidence of scoliosis in the state of delaware;a study of 50,000 minifilms of the chest made during a survey for tuberculosis.J Bone Joint Surg Am,1955,37-A(6):1243-1249.

[3]Xue X,Shen J,Zhang J,et al.Rib deformities in congenital scoliosis.Spine(Phila Pa 1976),2013,38(26):E1656-E1661.

[4]Shen J,Zhang J,Feng F,et al.Corrective surgery for congenital scoliosis associated with split cord malformation:It may be safe to leave diastematomyelia untreated in patients with intact or stable neurological status.J Bone Joint Surg Am,2016,98(11):926-936.

[5]Feng F,Shen J,Zhang J,et al.Characteristics and clinical relevance of the osseous spur in patients with congenital scoliosis and split spinal cord malformation.J Bone Joint SurgAm,2016,98(24):2096-2102.

[6]Xue X,Shen J,Zhang J,et al.An analysis of thoracic cage deformities and pulmonary function tests in congenital scoliosis.Eur Spine J,2015,24(7):1415-1421.

[7]Shen J,Wang Z,Liu J,et al.Abnormalities associated with congenital scoliosis:A retrospective study of 226 chinese surgical cases.Spine(Phila Pa 1976),2013,38(10):814-818.

[8]Feng F,Shen J,Zhang J,et al.Clinical outcomes of different surgical strategy for patients with congenital scoliosis and type i split cord malformation.Spine(Phila Pa 1976),2016,41(16):1310-1316.

[9] Li Z,Yu X,Shen J.Environmental aspects of congenital scoliosis.Environmental science and pollution research international,2015,22(8):5751-5755.

[10]Sirbu IO,Duester G.Retinoic-acid signalling in node ectoderm and posterior neural plate directs left-right patterning of somitic mesoderm.Nat Cell Biol,2006,8(3):271-277.

[11]Gudas LJ.Retinoids and vertebrate development.J Biol Chem,1994,269(22):15399-15402.

[12]Rubin WW,LaMantia AS.Age-dependent retinoic acid regulation of gene expression distinguishes the cervical,thoracic,lumbar,and sacral spinal cord regions during development.Dev Neurosci,1999,21(2):113-125.

[13]Duester G.Retinoic acid regulation of the somitogenesis clock.Birth Defects Res C Embryo Today,2007,81(2):84-92.

[14]Iulianella A,Beckett B,Petkovich M,et al.A molecular basis for retinoic acid-induced axial truncation.Dev Biol,1999,205(1):33-48.

[15]王陇德.中国居民营养与健康状况调查报告.北京:人民卫生出版社,2005.

[16]于江荣,刘纯艳.孕妇维生素a摄入现状调查及营养干预效果评价.中国实用护理杂志,2010,26(7):62-63.

[17]李燕蓉,梁竹巍,王蕊,等.母血与脐血中vita vitc vitd vite含量及其相关性.中国妇幼保健,2007,22(7):864-865.

[18]曲巧玲.孕妇维生素和微量元素状况对胎儿生长发育的影响.临床医学工程,2011,2(12):1913-1914.

[19]张露平,王歆莉,李燕蓉,等.妊娠早期血清维生素a、e水平的临床观察.首都医科大学学报,2013,34(5):756-758.

[20]Sandell LL,Lynn ML,Inman KE,et al.Rdh10 oxidation of vitamin a is a critical control step in synthesis of retinoic acid during mouse embryogenesis.PLoS One,2012,7(2):e30698.

[21]Duester G.Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis.Cell,2008,134(6):921-931.

[22]Sandell LL,Sanderson BW,Moiseyev G,et al.Rdh10 is essential for synthesis of embryonic retinoic acid and is required for limb,craniofacial,and organ development.Genes&development,2007,21(9):1113-1124.

[23]Li Z,Shen J,Wu WK,et al.Vitamin a deficiency induces congenital spinal deformities in rats.PLoS One,2012,7(10):e46565.

[24]Giguere V,Ong ES,Segui P,et al.Identification of a receptor for the morphogen retinoic acid.Nature,1987,330(6149):624-629.

[25]Petkovich M,Brand NJ,Krust A,et al.A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors.Nature,1987,330(6147):444-450.

[26]Wiper-Bergeron N,St-Louis C,Lee JM.Ccaat/enhancer binding protein beta abrogates retinoic acid-induced osteoblast differentiation via repression of runx2 transcription.Molecular endocrinology(Baltimore,Md),2007,21(9):2124-2135.

[27]Skillington J,Choy L,Derynck R.Bone morphogenetic protein and retinoic acid signaling cooperate to induce osteoblast differentiation of preadipocytes.J Cell Biol,2002,159(1):135-146.

[28]Rochette-Egly C,Adam S,Rossignol M,et al.Stimulation of rar alpha activation function af-1 through binding to the general transcription factor tfiih and phosphorylation by cdk7.Cell,1997,90(1):97-107.

[29]Minucci S,Pelicci PG.Retinoid receptors in health and disease:Co-regulators and the chromatin connection.Semin Cell Dev Biol,1999,10(2):215-225.

[30]Janesick A,Tang W,Nguyen TTL,et al.Rarbeta2 is re-quired for vertebrate somitogenesis.Development,2017,144(11):1997-2008.

[31]刘桂中,赵剑华.维甲酸信号通路的生物学进展.生理科学进展,2000,31(4):337-340.

[32]Hesemann J,Lauer E,Ziska S,et al.Analysis of maternal risk factors associated with congenital vertebral malformations.Spine(Phila Pa 1976),2013,38(5):E293-E298.

[33]Barnes GL Jr,Mariani BD,Tuan RS.Valproic acid-induced somite teratogenesis in the chick embryo:Relationship with pax-1 gene expression.Teratology,1996,54(2):93-102.

[34]Barnes GL,Alexander PG,Hsu CW,et al.Cloning and characterization of chicken paraxis:A regulator of paraxial mesoderm development and somite formation.Dev Biol,1997,189(1):95-111.

[35]Webster WS,Abela D.The effect of hypoxia in development.Birth Defects Res C Embryo Today,2007,81(3):215-228.

[36]Singh J.Interaction of maternal protein and carbon monoxide on pup mortality in mice:Implications for global infant mortality.Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol,2006,77(3):216-226.

[37]DeSesso JM,Jacobson CF,Scialli AR,et al.An assessment of the developmental toxicity of inorganic arsenic.Reprod Toxicol,1998,12(4):385-433.

[38]Aberg A,Westbom L,Kallen B.Congenital malformations among infants whose mothers had gestational diabetes or preexisting diabetes.Early Hum Dev,2001,61(2):85-95.

[39]Rashbass P,Wilson V,Rosen B,et al.Alterations in gene expression during mesoderm formation and axial patterning in brachyury(t)embryos.Int J Dev Biol,1994,38(1):35-44.

[40]Kim PC,Mo R,Hui Cc C.Murine models of vacterl syndrome:Role of sonic hedgehog signaling pathway.J Pediatr Surg,2001,36(2):381-384.

[41]Loeken MR.Current perspectives on the causes of neural tube defects resulting from diabetic pregnancy.Am J Med Genet,2005,135c(1):77-87.

[42]Dunty WC Jr,Chen SY,Zucker RM,et al.Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis:Implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.Alcohol Clin Exp Res,2001,25(10):1523-1535.

[43]Breen JG,Claggett TW,Kimmel GL,et al.Heat shock during rat embryo development in vitro results in decreased mitosis and abundant cell death.Reprod Toxicol(Elmsford,NY),1999,13(1):31-39.

[44]Hubaud A,Pourquie O.Signalling dynamics in vertebrate segmentation.Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(11):709-721.

[45]Cooke J,Zeeman EC.A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.J Theor Biol,1976,58(2):455-476.

[46]Pourquie O.The segmentation clock:Converting embryonic time into spatial pattern.Science(New York,NY),2003,301(5631):328-330.

[47]Jouve C,Palmeirim I,Henrique D,et al.Notch signalling is required for cyclic expression of the hairy-like gene hes1 in the presomitic mesoderm.Development,2000,127(7):1421-1429.

[48]Palmeirim I,Henrique D,Ish-Horowicz D,et al.Avian hairy gene expression identifies a molecular clock linked to vertebrate segmentation and somitogenesis.Cell,1997,91(5):639-648.

[49]Jiang YJ,Aerne BL,Smithers L,et al.Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.Nature,2000,408(6811):475-479.

[50]Dias AS,de Almeida I,Belmonte JM,et al.Somites without a clock.Science(New York,NY),2014,343(6172):791-795.

[51]Wahi K,Bochter MS,Cole SE.The many roles of notch signaling during vertebrate somitogenesis.Semin Cell Dev Biol,2016,49:68-75.

[52]Rankin SA,McCracken KW,Luedeke DM,et al.Timing is everything:Reiterative wnt,bmp and ra signaling regulate developmental competence during endoderm organogenesis.Dev Biol,2018,434(1):121-132.

[53]Echeverri K,Oates AC.Coordination of symmetric cyclic gene expression during somitogenesis by suppressor of hairless involves regulation of retinoic acid catabolism.Dev Biol,2007,301(2):388-403.

[54]Vilhais-Neto GC,Fournier M,Plassat JL,et al.The whhere coactivator complex is required for retinoic acid-dependent regulation of embryonic symmetry.Nat Commun,2017,8(1):728.

[55]Kumar S,Duester G.Retinoic acid controls body axis extension by directly repressing fgf8 transcription.Development,2014,141(15):2972-2977.

[56]Cunningham TJ,Kumar S,Yamaguchi TP,et al.Wnt8a and wnt3a cooperate in the axial stem cell niche to promote mammalian body axis extension.Dev Dyn,2015,244(6):797-807.

[57]Pasini A,Manenti R,Rothbacher U,et al.Antagonizing retinoic acid and fgf/mapk pathways control posterior body patterning in the invertebrate chordate ciona intestinalis.PLoS One,2012,7(9):e46193.

[58]Farrell JA,Wang Y,Riesenfeld SJ,et al.Single-cell reconstruction of developmental trajectories during zebrafish embryogenesis.Science,2018,360(6392).