野坝子多糖含量的测定

张玉婷，文美琼

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)

多糖类化合物是一类重要的广泛存在于自然界的有机化合物，是目前备受关注的产物之一。植物多糖具有广泛的药理作用，参与机体各种生理代谢，具有调节机体免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多种生物活性[1―2]。

野坝子(Elsholtziarugulosa)是一种非常常见的植物，还是一种药食同源的植物，来源非常广泛。野坝子是汉药名，它有许多种叫法，如：野坝蒿、野拔子、野苏草、野香苏、小铁苏、夸巴脂、草拔子、扫把茶、草芝麻蒿、皱叶香薷等等。野坝子始载于《中国彝药学》，在《全国中药汇编》中记载了它的药效[3]。其味辛、性凉，具疏风解表，利湿、消食化积等功效。用于治疗四季感冒、咽喉炎、消化不良、腹满胀痛、泄泻、急性肠炎、溃烂疮疡、中耳炎等[4]。

迄今为止，有不少学者对野坝子进行了许多研究，如：野坝子微量元素分析[4]、红外光谱分析[5]、化学成分分析[6]，总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用[3]等，但对其中的多糖含量的研究尚未见报道。本文对野坝子中多糖的含量进行测定，旨在为它的综合应用提供理论依据。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

样品野坝子于2014年12月采自云南楚雄西山。

1.1.2 试剂

葡萄糖标准品(南京春秋生物工程有限公司)，活性炭、石油醚、无水乙醇、苯酚、硫酸、铝粉、碳酸氢钠、丙酮等均为分析纯，水为楚雄师范学院实验室自制超纯水。

1.1.3 仪器

SHZ-A(Ⅲ)型循环水式多用真空泵(河南省豫华仪器有限公司)；Alpha-1502型紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)； HH-2型恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；80-2离心机、202-2型干燥箱(中华人民共和国上海市实验仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 原料处理

将野坝子地上部分自然晾干， 60℃烘干，将其用粉碎机粉碎，样品密封保存备用。

2.2 多糖的测定[7―10]

2.2.1 多糖的提取与精制

准确称取野坝子地上部分样品粗粉5.0000g，用滤纸包好。先加入石油醚80mL，水浴回流1h，样品再用80mL80%乙醇水浴回流1h，在室温条件下挥干乙醇；将挥干乙醇的样品回流提取三次(1h、1h、0.5h)，每次加入超纯水80mL。用抽滤机趁热抽滤，将三次滤液合并，用活性炭脱色大约半小时，又抽滤，将滤液水浴浓缩至40mL，流水冷却，然后定容到50mL容量瓶中制得提取液；用吸量管精确吸取1mL提取液放于离心试管中，然后加入7mL无水乙醇，搅拌，离心(4000r/m， 10min)，弃去上层清液，用热水溶解沉淀，定容至10mL，制得样品液。

精密称取铁皮石斛样品粗粉3.0000g，按“多糖的提取”方法进行提取，滤液浓缩至80mL，加入无水乙醇至溶液含醇80%，静置过夜。过滤，用无水乙醇、丙酮依次洗涤沉淀，制得多糖精制品，60℃烘干1h后保存备用。

2.2.2 提取液中多糖的定性检验

吸取1mL提取液置于试管中，先加入几滴5%的苯酚溶液，摇匀后加入几滴浓硫酸，再摇匀，结果溶液出现棕色环，说明野坝子的提取液中含有多糖。

2.2.3 苯酚、葡萄糖标准溶液的配制

称取苯酚100g， 铝粉0.10g和碳酸氢钠0.05g，混匀后常压蒸馏，用温度计测量温度，收集182℃的馏分。称取馏分5g，然后加入100mL超纯水混匀后，将其转移到棕色试剂瓶中，制得5%的苯酚溶液。

精确称取葡萄糖标准品0.1000g，溶解并定容于100mL容量瓶中。用吸量管精密吸取10mL溶液置于100mL容量瓶中定容并摇匀，即得浓度为100μg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.2.4 测定波长的选择

测得葡萄糖标准溶液和样品溶液最大吸收波峰分别在490nm和485nm处，故确定试验的测定波长为490nm。

2.2.5 葡萄糖标准曲线的绘制

分别吸取葡萄糖标准溶液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL分别置于8支比色管中，分别向这八支比色管中加入超纯水至2.00mL，按照上面“测定波长的选择”进行显色，以试剂空白为参比，在490nm处测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，计算回归方程。

求得葡萄糖含量c (μg/mL)与吸光度A间的回归方程为：A = 0.0125c + 0.0023 ，R2= 0.9992，表明葡萄糖浓度在0―35μg/mL范围内与吸光度A呈良好的线性关系。

2.2.6 显色稳定性实验

吸取葡萄糖标准溶液和样品液各0.40mL，加超纯水至2.00mL，按照上面“测定波长的选择”来进行显色，分别测定0min、5min、10min，直至60min的吸光度。

结果表明葡萄糖标准溶液及样品液显色后在60min内其吸光度值变化不大，具有一定的稳定性。葡萄糖显色溶液在20―35min的时间内其吸光度值不变，样品显色液在15―40min的时间内其吸光度值不变，因此选择在显色26min后来测定溶液的吸光度。

1)当NH(q)>Q*时，收益表达式为(36)，对公式(36)分别求q，α，β三者的一、二阶导数，求解最优的订货量以及弹性系数.

2.2.7 测定换算因数

精确称取烘干后的多糖精制品0.0106g、0.0105g、0.0104g三份，分别定容到50mL容量瓶中制得溶液。分别用2mL吸量管分别精取多糖溶液1.7mL，加超纯水至2mL，按照上面“测定波长的选择”处的做法来进行显色，重复做三次取平均值。

换算因数计算公式如下：

F = M/(C·D)

M为多糖质量；

C为多糖液中的葡萄糖浓度；

D为多糖的稀释倍数。

根据以上计算公式，计算结果换算因数F为5.46。

2.2.8 多糖含量的测定(重复性试验)

分别用1mL吸量管精确吸取样品液0.50mL置于比色管中，加超纯水至2.00mL，按照上面“测定波长的选择”的做法来进行显色，测定其吸光度，每个样品液平行显色三次取平均值。计算样品中多糖的含量。

M多糖= F × M葡萄糖

表1 多糖含量

计算结果为野坝子多糖含量为7.96%，RSD为0.24%，说明重复性较好。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

用吸量管精确吸取样品液0.50mL置于比色管中，加超纯水至2.00mL，按照上面“测定波长的选择”的做法来进行显色，测定吸光度，平行测定5次。

表2 精密度试验结果

测定结果见表2，计算RSD为0.26%，表明精密度好。

2.3.2 加标回收率试验[11]

精确称取野坝子地上部分粗粉三份，质量分别为5.0005g，5.0004g，5.0009g，分别向其中加入一定质量的多糖精制品，用滤纸包好，如“多糖的提取”操作，制得3份待测液。分别向三份待测液中吸取一定体积的溶液，按照上面“测定波长的选择”的做法来进行显色，测定其吸光度，每份待测液平行显色三次，取其吸光度平均值计算。

表3 回收率实验结果

由表3表明，样品回收率在90.02%到94.51%之间，表明准确度较高。

3 结论

本实验通过回流提取法来提取野坝子中的多糖，利用苯酚-浓硫酸显色法，根据吸光度与葡萄糖浓度成线性关系成正比，以此来测定其含量。结果测得野坝子中的多糖含量为7.96%，试验结果的重复性好( RSD=0.24%，n=8)，精密度高(RSD=0.26%，n=5)，准确度也较高(样品回收率在90.02%到94.51%之间，RSD=1.43%，n=3)。

[1]郑永飞.活性多糖的保健功能及其应用[J].粮食与食品工业，2009，16(4):22―25.

[2]申利红，王建森，李雅，等.植物多糖的研究及应用进展[J].中国农学通报.2011， 27(2):349―352.

[3]文美琼，李璐，杨申明，等.彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用[J].时珍国医国药，2010，21(6):1444―1445.

[4]杨永寿，肖培云，董光平，等. 白族药野坝子的微量元素分析[J]. 微量元素与健康研究，2002，19(3):34―35.

[5]张丽梅，王怡林，董勤，等.彝药野坝子FTIR光谱分析[J].楚雄师范学院学报，2005， 20(6):27.

[6]赵勇，李庆春，赵焱，等.野坝子的化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2004，29(12)：1144.

[7] 文美琼，李璐，杨申明，等.龙陵县不同时期铁皮石斛不同部位多糖及生物碱含量比较分析[J]. 中国民族民间医药，2015，24(10):15―17.

[8]张惟杰主编.糖复合物生化研究技术(第二版)[M].杭州:浙江大学出版社，1998.

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[11]聂国朝.中药木瓜多糖的提取分离及含量测定[J].微量元素与健康研究，2003，20(5):30―38.