化橘红、连翘、当归混合挥发油提取及包合工艺研究

王文平 倪健 杨春静 张欣 王庆玲 董晓旭 冷新 尹兴斌 冯淬灵

化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，前者习称“毛橘红”，后者习称“光七爪”“光五爪”[1]，味辛、苦，性温，归肺、脾经，其功能是理气宽中、燥湿化痰。药理研究表明[2]化橘红挥发油有明显的镇咳、化痰作用。连翘为木犀科植物连翘Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果实，味苦，性微寒，具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的作用。文献研究表明[3]，连翘挥发油具有抗炎作用，抗炎机理与抑制炎症介质PGE2和组胺、五羟色胺的释放有关。当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥块根，具有补血活血，补气调经等功效[4]。当归挥发油中的藁本内酯具有较强的解痉平喘作用[5]，可松弛支气管平滑肌，对抗组织胺、乙酰胆碱引起的支气管哮喘。

慢阻肺(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)与肺部的异常炎症有关[6-7]，主要症状为气短、慢性咳嗽、咳痰、喘息和胸闷。芪蛭益肺颗粒是北京中医药大学东直门医院治疗COPD的临床经验方，方中化橘红、当归、连翘三味药的挥发油对COPD症状有明显治疗作用，故本实验对以上三味药采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，以挥发油的得率为指标，优化挥发油的提取工艺；为减少挥发油成分在制剂生产及储藏过程损失，同时为了更好地将挥发油成分与水提浸膏混合，本实验对混合挥发油进行包合，并以挥发油的得率为指标，优化挥发油的包合工艺[8]，并利用显微成像分析和X射线衍射法对包合物进行表征。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZNCL-S-10D多点智能磁力搅拌器(河南爱博特科技发展有限公司)，ZDHW型调温电热套(北京市中兴伟业仪器有限公司，BT125D型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，DZ-28BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，XD-3X射线衍射仪(北京普析通用仪器有限公司)，Olympus显微系统和DP71图像采集系统。

1.2 试药

药材购自北京同仁堂(亳州)饮片公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定：化橘红(生产批号：501002809)为芸香科植物柚Citrusgrandis‘Tomentosa’的干燥外层果皮，连翘(生产批号：500003182)为木犀科植物连翘Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果实，当归(生产批号：501002827)为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥块根。β-环糊精(分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号20151030)，无水乙醇(北京化工厂，批号：20160606)实验用水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 混合挥发油的提取

称取化橘红、连翘、当归饮片，按照2015年版《中华人民共和国药典》(四部)附录2204挥发油测定法(甲法)提取，收集挥发油。化橘红、连翘、当归混合油为黄色透明液体，用封口膜密闭，置于4℃冷藏备用。

2.1.1 单因素考察 以挥发油的得率为指标，采用单因素实验考察浸泡与否、加水倍量、提取时间对化橘红、当归、连翘混合挥发油得率的影响。将当归破碎成2 cm左右小块，化橘红、连翘不粉碎进行挥发油提取。放大药量至三味药各加200 g，共600 g，进行混合油最佳提取工艺的筛选。

2.1.2 浸泡与否的考察 称取化橘红、当归、连翘各200 g，共600 g，加入12倍量的水，分别浸泡0、2小时后提取。挥发油的提取量分别为2.88 mL、2.89 mL，由此得出结论：浸泡与否对于挥发油的得率没有显著影响，故选择不浸泡提取挥发油，减少了工序，节省了时间和成本。

2.1.3 挥发油提取工艺的考察 称取化橘红、当归、连翘药材各200 g，共600 g，分别加入10、12、14倍量的水，提取挥发油，记录不同时间挥发油的提取量，为保持实验结果的准确性，选择同一电热套、同一挥发油提取器，并且在提取过程中控制相同的温度，本实验控制加热条件，即调至360 V至沸腾，之后降至250 V保持微沸。实验结果如表1所示。实验结果表明12倍量水提取所得挥发油量最大，挥发油得率为0.48%，并且提取10小时后挥发油提取量已达总量的90%，综合中试加工时间限制及提取成本因素，选择最佳提取工艺为12倍量水提取10小时。

2.1.4 验证实验 按照优选出来的挥发油的提取工艺，即化橘红、连翘、当归每味药加入200 g，不浸泡，加入12倍量水，提取10小时，平行进行3次验证实验，实验结果如表2所示。实验结果表明该挥发油提取工艺稳定可行。

表1 挥发油提取工艺结果

表2 挥发油提取验证实验

2.2 包合工艺的考察

2.2.1 空白回收率 实验取1 mL挥发油于500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水，测得挥发油的空白回收率为80%。

2.2.2 正交实验 设计通过查阅文献[9-10]及综合考虑挥发油包合物制备方法，选择饱和水溶液法对挥发油进行包合。正交实验采用L9(34)正交设计表，以挥发油的包合率为指标，考察影响包合物生成的三因素包合温度、包合时间、油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例对包合物生成的影响，每个因素下三个水平。因素水平见表3。

表3 包合工艺正交试验因素水平表

2.2.3 包合物的制备 按照正交表4，称取规定重量的β-CD于锥形瓶中，分别加入蒸馏水60 mL、80 mL、100 mL于设定好温度的水浴锅上加热溶解，制成β-CD饱和溶液，置于磁力搅拌器上恒温。挥发油1 mL加无水乙醇制成50%(v/v)的无水乙醇溶液，超声使油与无水乙醇混合均匀，之后缓慢加入到环糊精溶液中，加塞，搅拌至规定时间，冷却至室温，放入冰箱，冷藏24小时，抽滤，包合物用适量的水洗涤，再用10 mL无水乙醇洗涤，滤层和滤纸一同取出，置于真空干燥箱中，40℃下干燥4小时，即得。

2.2.4 包合率的测定 分别取9组干燥好的包合物，置于500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水，连接挥发油提取装置，提取挥发油，保持微沸5小时，至油量不再增加，计算挥发油的包合率，结果见表4，方差分析结果见表5。结果分析：由方差分析结果显示，A、B、C三因素的P值均小于0.05，说明A、B、C三因素均具有显著性差异，通过k值比较，最终确定最佳提取工艺为A2B3C3，即40℃，油(mL)∶β-CD(g)∶比例为1∶10∶100，提取3小时。

表4 混合挥发油β-CD包合工艺正交实验结果

表5 混合挥发油β-CD包合工艺的方差分析

2.2.5 三批验证实验 按照优选的挥发油的最佳包合工艺，进行3批平行验证实验，结果见表6，三批验证试验平均包合率为95.83%，大于正交表中的最佳包合率93.75%，说明该包合工艺稳定可行。

表6 挥发油包合验证实验

2.3 包合物表征

2.3.1 包合物的显微成像 分别取适量β-CD、挥发油与β-CD物理混合物及包合物，过100目筛，分别放于3张载玻片上，以少量蒸馏水分散溶解，盖上盖玻片，于10×10倍显微镜下观察。β-CD、挥发油与β-CD物理混合物、挥发油包合物显微图分别如图1所示。β-CD在显微镜下呈不规则透明团块，成像清晰；物理混合物类似于β-CD，且有大量细小油滴存在。包合物的显微图与以上二者具有明显区别，包合物已经形成且包合状态良好。

注：A为β-CD；B为物理混合物；C为包合物

2.3.2 X射线衍射法 取空白β-CD、混合挥发油与β-CD的物理混合物、β-CD与混合油的包合物分别进行X射线衍射，以扫描角度为横坐标，衍射强度为纵坐标，采用Origin软件绘制X射线粉末衍射图。结果如图2所示。由图所示，包合物的衍射峰在2θ=6～8°、 16～18°、 20°、 24°产生新的吸收峰，在2θ=10°、 26～27°、 32°、 35°的峰消失，说明混合油与β-CD形成了包合物。

注：A为β-CD；B为物理混合物；C为包合物

3 讨论

本实验利用现代包合技术，将挥发油包合在β-CD分子之中，获得稳定的包合物。本研究结果显示，最佳提取工艺是不浸泡，加10倍量水，提12小时。最佳包合工艺为：油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例为1∶10∶100，包合温度为40℃，包合时间为3小时。通过显微镜法、X射线衍射法对挥发油进行表征，结果显示包合物形成且包合状态良好。该工艺操作方便，实用性强，有利于生产。

化橘红、当归、连翘的混合挥发油成分比较复杂，单凭挥发油的提取率和包合率来表示挥发油的提取会有一定的局限性。后期可以测定一下不同提取工艺和包合工艺中各成分含量差别进行完善。

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