不同产地山豆根UPLC指纹图谱的研究

程钱 赵崇军 代一航 汪建芬 夏青 张文婷 王金凤 马志强 林瑞超

山豆根为豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根和根茎，而北豆根为防己科植物蝙蝠葛MertispermumdauricumDC.的干燥根茎[1]。山豆根主要分布于广西百色、东兰县、金城江、云南等地，北豆根则主要分布在北方，湖北亦有[2]。两者皆性寒味苦，有清热解毒，消肿利咽之功效，但山豆根毒性比北豆根较强[3]。因山豆根与北豆根有相似的功效，植物形态相似，所以在民间常把两者混用，因此中毒事件也是屡见报道[4]。李妃等[5]对山豆根的化学成分、药理作用、毒理作用以及毒性成分检测等内容进行了较为详细的总结和讨论。超高效液相色谱法(ultra-high performance liquid chromatography，UPLC)是近些年新型的色谱分离分析技术，采用了更为细小的1.8 μm填料的色谱柱，相对于传统的HPLC，有更好的分离效率及灵敏度[6]，本文采用UPLC对不同产地山豆根进行指纹图谱研究，为综合评价和控制山豆根的质量提供了科学依据，也为区分山豆根与北豆根提供了研究思路。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters科技有限公司)，98-1-B型电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)，NewClassic MF电子分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 药材样品

实验所用的山豆根及北豆根药材样品从广西、云南、湖北等地采集，见表1。样品经北京中医药大学中药学院中药鉴定系王晶娟副教授鉴定为山豆根SophoratonkinensisGagnep.。苦参碱和氧化苦参碱对照品(均由成都普思生物科技有限公司提供，批号分别为PS0187-0010、 PS0187-020，纯度均≥98%)；乙腈为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

表1 山豆根及北豆根产地及采摘日期

1.3 色谱条件

Agilent Zorbax SB C-18 RRHD色谱柱(2.1×100 mm，1.8 μm)，流速0.3 mL/min，检测波长215 nm，柱温30℃，理论板数以氧化苦参碱计不低于4000，流动相乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱(0～5分钟，5%A；5～6分钟，5%～9%A；6～6.5分钟，9%～12%A；6.5～11分钟，12%～15%A；11～21分钟，15%～34%A；21～23分钟，34%～45%A；23～26分钟，45%～47%A；26～27分钟，47%～77%A；27～35分钟，77%～98%A)。

1.4 供试品溶液的制备

精密称定山豆根粉末2.5 g，置圆底烧瓶中，加入无水乙醇-氨水(3∶2)1 mL[7]，放置0.5小时后加入70%甲醇25 mL，在电热套上加热回流2小时，冷却，滤过，回收溶剂，残渣加适量甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

1.5 对照品溶液的配制

分别取苦参碱和氧化苦参碱对照品约6 mg、10 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.6 方法学考察

1.6.1 精密度试验 精密称定S1号山豆根药材粉末2.5 g，按1.4项下的方法制备供试品溶液，按1.3项下的色谱条件连续进样6次，测定，结果显示，各色谱峰相对保留时间RSD 0.05%～0.3%；各色谱峰相对峰面积RSD 0.5%～3.6%，表明仪器精密度良好。

1.6.2 重复性试验 精密称定S1号山豆根药材粉末6份，每份2.5 g，按1.4项下的方法制备供试品溶液，按1.3项下的色谱条件进行测定。结果显示，6份样品的各色谱峰相对保留时间RSD 0.02%～0.15%；各色谱峰相对峰面积 RSD 1.8%～3.9%，表明样品重复性良好。

1.6.3 稳定性试验 取重复性试验项下的一供试品溶液，按1.3项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24小时进行测定。结果显示，各色谱峰相对保留时间RSD 0.05%～0.4%,各色谱峰相对峰面积RSD 0.6%～4.1%,表明供试品溶液在24小时内稳定。

2 结果

2.1 各个批次指纹图谱的采集

精密称定各个批次山豆根药材粉末2.5 g，按照1.4项下的方法制备供试品溶液，并按照1.3项下的色谱条件进行测定，记录10批次山豆根的色谱图，以《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》建立山豆根药材UPLC指纹图谱。

2.2 参照色谱峰的建立

本实验中的苦参碱和氧化苦参碱为山豆根中的共有成分，含量较高，且氧化苦参碱的保留时间比苦参碱稍长，故选用氧化苦参碱(7号峰)为参照峰，见图1。

注：5：苦参碱；7：氧化苦参碱。

2.3 共有峰的确定

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》对各批次色谱图进行分析，各个批次都具有的色谱峰标定为共有色谱峰。本文共标定29个共有峰，见图2。相似度软件设置，选择S1号山豆根药材的色谱图为参照图谱，以中位数法作为生成对照指纹图谱的方法，设定时间窗宽度为0.2分钟，软件自动进行多点校正，全峰匹配，系统根据各个批次样品色谱图的共有模式生成对照指纹图谱作为山豆根的指纹图谱。以参照峰的保留时间和峰面积为基准1，分别计算10批山豆根药材共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2、3。结果表明不同批次山豆根药材共有峰相对保留时间RSD 3.925%～4.588%，而相对峰面积的RSD 较大。由此可知，不同批次山豆根具有相似的成分，但是不同批次相似成分的含量却相差较大。

2.4 共有峰的指认

利用对照品对照法对共有峰进行指认，取苦参碱、氧化苦参碱适量配成对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，得到5号峰、7号峰两个色谱峰和对照品的保留时间一致，并且通过PDA检测器紫外吸收光谱进行对比，结果均一致，因此确定5号峰为苦参碱，7号峰为氧化苦参碱。

2.5 山豆根相似度评价

本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》对10批山豆根药材UPLC指纹图谱进行相似度计算，见表4。

3 讨论

提取方法的选择：本文在综合参考相关文献[8-9]的基础上, 结合药材的化学成分属性和提取效率等因素，考察了不同的提取方法，结果显示，加入无水乙醇-氨水(3∶2)适量0.5小时后，以十倍药材量70%甲醇提取2小时，提取效果较好，供试品色谱峰较多，可更大程度地反应药材的特征信息。

检测波长的选择：本文选用了Waters超高效液相色谱二极管阵列检测器，对样品进行了全波长的扫描，在遵循信息最大量的原则下，经过比较发现，215 nm时，色谱图峰数量丰富、分离度较好，基线平稳。因此以215 nm作为检测波长。

图2 S1号山豆根药材色谱图

表2 10批山豆根药材样品共有峰相对保留时间

表3 10批山豆根样品共有峰相对峰面积

表4 山豆根药材UPLC指纹图谱相似度计算

注： SR—由软件生成的对照指纹图谱。

图3 共有模式建立对照指纹图谱

图4 10批山豆根(S1-S10)和2批北豆根(S11-S12)UPLC叠加色谱

实验的创新之处：本文运用了目前分离效率和效果较高的超高效液相色谱技术，与传统的高效液相色谱比较，其在分离效率和分析能力上均有较大的进步，为首次使用UPLC对不同产地的山豆根指纹图谱进行了研究。同时，该研究对于中药材等复杂样品的成分分析与质量控制，具有很好的适用性和优势。同时本文从色谱指纹图谱的角度为分析山豆根与北豆根区别提供了思路，有一定实用价值。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社， 2005.

[2] 李可强,刘威,张振秋. HPLC法测定北豆根药材中粉防己碱和青藤碱[J]. 中草药,2008,39(4):607-609.

[3] 周友红,呼海涛.山豆根不可与北豆根混用[J].中国民族民间医药,2008,17(2):55-56.

[4] 孙蓉,王晨.北豆根毒性研究进展[J].中国药物警戒,2009,6(9):546-549.

[5] 李妃,李成平,付晖,等.山豆根研究进展及毒性成分检测方法补充报道[J].药物分析,2013,33(8):1453-1463.

[6] 刘芷,贾英,赵旭,等. 五味子的UPLC指纹图谱研究[J].中草药,2014, 45(11):1631-1633.

[7] 刘吉成,卢森华,谢巍,等. 广西多叶越南槐HPLC指纹图谱的建立及与山豆根HPLC指纹图谱一致性比较研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014,20(23):89-94.

[8] 黄亚非,黄际薇,陶玲,等. 广西不同产地山豆根的指纹图谱特征研究[J]. 中药材,2005,28(1) :21.

[9] 黄颖,王乃平,陈勇. 广西产山豆根HPLC指纹图谱测定[J]. 中国实验方剂学杂志,2011,17(14):66.