衍生化GC-MS法测定甲磺酸萘莫司他原料药中甲磺酸甲酯与甲磺酸乙酯

刘晓强,丁 建

(常州市食品药品监督检验中心,常州 213101)

甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate)化学名为6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸盐,是Japan Tobacco公司研发的非肽类蛋白酶抑制剂[1],首次上市是在1986年的日本,主治临床急性胰腺炎[2-3]。在甲磺酸萘莫司他的制备工艺中,由于所用原料、试剂等多种因素影响,在制得的甲磺酸萘莫司他原料药中可能会有甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)等杂质生成[4-5]。而甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯等甲磺酸酯类化合物均具有较强的潜在性遗传毒性杂质,严重威胁患者的健康,故需要对其含量进行控制[5]。

1 仪器与试药

1.1仪器 GCMS-QP-2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；XS105DU电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试药 甲磺酸萘莫司他(江苏杜瑞制药有限公司,批号840901)；甲磺酸甲酯对照品(百灵威科技有限公司,批号LSB0N36,质量分数99%)；甲磺酸乙酯对照品(阿法埃莎化学有限公司,批号10169291,质量分数99%)；乙腈为色谱纯(德国默克公司)；实验用水为纯净水；碘化钠和无水硫代硫酸钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：HP-INNOWAX(安捷伦科技有限公司,30 m×0.250 mm,0.50 μm)；进样口温度：200 ℃；柱温：采用程序升温法,起始温度设为35 ℃,维持3 min,再以30 ℃·min-1的速率升温至180 ℃,维持2 min；载气类型：氦气；载气流速：恒压模式(100 kPa)；进样量：1.0 mL；分流比：1∶12；平衡时间：30 min；进样方式：顶空进样；平衡温度：60 ℃。

质谱：离子源温度：250 ℃；接口温度：150 ℃；电离源：电子轰击离子化(EI)；分析器：四级杆质量分析器；离子源温度：250 ℃。选择性离子模式(SIM)检测,碘代丁烷(BuI)定量离子m/z为184,碘代甲烷(MeI)为142,碘代乙烷(EtI)为156,BuI、MeI和EtI依次由甲磺酸丁酯(BMS)、甲磺酸甲酯(MMS)及甲磺酸乙酯(EMS)经衍生化反应形成。

2.2溶液的制备

2.2.1衍生化溶液 称取碘化钠60.0 g和无水硫代硫酸钠30 mg,置于同一50 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(避光保存)。

2.2.2内标溶液 精密量取甲磺酸丁酯50 μL,置于50 mL量瓶中,用乙腈-水(8∶2)稀释至刻度,摇匀；精密量取上述溶液500 μL,置于250 mL量瓶中,用乙腈-水(2∶8)稀释至刻度,摇匀；再精密量取上述溶液100 mL,置于1 000 mL量瓶中,同样用乙腈-水(2∶8)稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.3对照品储备液 精密称取甲磺酸甲酯及甲磺酸乙酯各25 mg,共同置于5 mL量瓶中,用甲苯溶解并稀释至刻度,摇匀；精密量取上述溶液50 μL,移至25 mL量瓶中,加乙腈2 mL,用内标溶液稀释至刻度,制成每1 mL中含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯各10 μg 的溶液,即得。

2.2.4对照品溶液(1) 精密量取2.2.3项下制备的对照品储备液50 μL,置于50 mL量瓶中,用内标溶液稀释至刻度；依次精密量取2.2.1项下制备的衍生化溶液与上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL顶空瓶中,压盖密封,摇匀,即得。

2.2.5对照品溶液(2) 精密量取2.2.3项下制备的对照品储备液150 μL,置于20 mL量瓶中,用内标溶液稀释至刻度；依次精密量取2.2.1项下制备的衍生化溶液与上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL顶空瓶中,压盖密封,摇匀,即得。

2.2.6供试品溶液 精密称取本品25 mg,置于20 mL顶空瓶中,依次精密加入2.2.1项下制备的衍生化溶液与2.2.2项下制备的内标溶液各0.5 mL,压盖密封,摇匀,即得。

2.3方法学验证

2.3.1标准曲线 分别取2.2.3项下制备的对照品储备液30,50,50,150和1 000 μL,分别置于100,50,20,20和50 mL量瓶中,用内标溶液稀释至刻度,使其质量浓度分别为3,10,25,75 和200 ng·mL-1。再依次量取上述各溶液0.5 mL,与2.2.1项下制备的衍生化溶液0.5 mL,共同置于20 mL顶空瓶中,压盖密封。

结果表明,甲磺酸甲酯拟合曲线为y=0.015 5x+0.152 1,r=0.997 5；甲磺酸乙酯拟合曲线为y=0.016x+0.007 1,r=0.999 9。甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯质量浓度在3.0～200.0 ng·mL-1的范围内线性关系良好。

2.3.2检出限和定量限 甲磺酸甲酯的定量限为2.892 8 ng·mL-1,信噪比为19.5∶1,检测限为0.964 3 ng·mL-1,信噪比为16.5∶1；甲磺酸乙酯的定量限为3.022 3 ng·mL-1,信噪比为13.8∶1,检测限为1.007 8 ng·mL-1,信噪比为9.7∶1。

2.3.3精密度 取2.2.3项下制备的对照品储备液150 μL,置于20 mL量瓶中,用内标溶液稀释至刻度,摇匀；依次取上述溶液及2.2.1项下制备的衍生化溶液各0.5 mL,共同置于20 mL顶空瓶中,立即密封。

甲磺酸甲酯的峰面积之比的RSD值为0.9%,甲磺酸乙酯的峰面积之比的RSD值为1.3%。

2.3.4加样回收率 分别取2.2.3项下制备的对照品储备液120,150和180 μL,分别置于20,20和20 mL量瓶中,用内标溶液稀释至刻度,摇匀；依次取上述各溶液0.5 mL、2.2.1项下制备的衍生化溶液0.5 mL及样品25 mg,共同置于20 mL顶空瓶中,压盖密封,制成含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯分别为低、中、高质量浓度的溶液各3份。

甲磺酸甲酯的平均回收率为102%,RSD值为2.9%；甲磺酸乙酯的平均回收率为106%,RSD值为1.2%,见表1～2。

表1甲磺酸甲酯加样回收率实验结果

Tab.1 The results of recovery tests of mthylmesylate (n=9)

表2甲磺酸乙酯加样回收率实验结果

Tab.2 The results of recovery tests of ethylmesylate (n=9)

2.4样品测定 样品中甲磺酸甲酯的含量为0.000 01%,甲磺酸乙酯的含量为0,甲磺酸酯的总含量为0.000 01%,见图1。结果表明,甲磺酸酯的总含量符合规定(标准规定：甲磺酸酯总含量不得超过0.000 5%)。

图1GC-MS图

A.对照品；B.样品；1.碘化甲烷；2.碘化乙烷3.碘化丁烷。

Fig.1 GC-MS chromatograms

A.reference substance；B.sample；1.methyl iodide；2.ethyl iodide；3.butane iodide.

3 小结

近年来,对各种原料药中甲磺酸酯类杂质检测研究的较多,常用的方法包括气相色谱法(GC-FID、GC-ECD)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)以及离子色谱等[6-12],笔者参考《欧洲药典》(EP)8.0版附录提出使用衍生化顶空GC-MS法测定甲磺酸酯类杂质含量的方法,本实验采用衍生化顶空GC-MS法,同时为了减少进样误差等因素对检测结果的影响,采用内标法进行样品的测定,选择待测物同系物甲磺酸丁酯为内标。

甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸丁酯沸点较高,均大于200 ℃[13],无法对其进行气化测定,因此实验采用柱前衍生化法,使甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丁酯与碘离子作用分别转化为碘代甲烷、碘代乙烷和碘代丁烷,沸点明显降低,适用于气相色谱法进行测定。同时,通过柱前衍生化法将原先的盐转化为中性物质,增强其在色谱柱上的保留行为,改善峰形,提高了柱效和检测灵敏度[14-17],有益于更好地控制甲磺酸萘莫司他中上述2种成分的含量。

直接进样法或顶空进样法均可测定甲磺酸酯类化合物的含量,但由于直接进样法操作简便,会将大量其余物质带入系统,增加系统污染风险,而顶空进样法可有效控制污染,通过柱前衍生化法,将待测物及内标物质转化为沸点降低的小分子物质,便于顶空进样的实施。

本次实验通过上述方法测定,得到甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的线性范围分别为3.0～200.0(r=0.997 5)和3.0～200.0 ng·mL-1(r=0.999 9)；检测限分别为0.964 3 和1.007 8 ng·mL-1；定量限分别为2.892 8和3.022 3 ng·mL-1；进样精密度的RSD值分别为0.9%和1.3%；平均加样回收率分别为102%(RSD=2.9%)和106%(RSD=1.2%)。

综上所述,本实验建立了柱前衍生化和GC-MS联用的方法测定甲磺酸萘莫司他中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量,该方法简单、灵敏度高、重复性好,可用于甲磺酸萘莫司他中甲磺酸酯类化合物的含量测定。

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