间充质干细胞旁分泌作用对外分泌腺腺体损伤后功能恢复的研究进展

曹璐 综述 王帅 张霓霓 黄桂林 审校

【提要】 各种物理性、机械性、化学性和病原微生物性的刺激均可能导致外分泌腺腺体的损伤，从而使其分泌功能下降。外分泌腺腺体损伤后药物治疗的效果有限，器官移植风险大且供体不足。而间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）因其强大的增殖能力、多向分化能力及旁分泌/自分泌作用，为修复各种外分泌腺损伤提供了一种新思路。本文就MSCs的旁分泌作用在外分泌腺组织工程中的应用及研究进展进行综述。

外分泌腺（Exocrine gland）是一类有导管（单细胞腺无导管）的腺体，其分泌物不进入血液，而由导管流出，如肝脏产生胆汁，通过胆总管流到十二指肠。唾液腺、汗腺、皮脂腺、肠腺、肝等均属于外分泌腺。胰腺是一种比较特殊的腺体，其外分泌部能产生胰液，由胰管流入十二指肠，属外分泌腺。而内分泌部是分布于胰腺中的小岛，叫胰岛，由A、B、C、D四种细胞组成，如B细胞能产生胰岛素，A细胞能产生胰高血糖素，由体内的血管运送到全身各处，所以胰岛属于内分泌腺。各种物理性、机械性、化学性和病原微生物性的刺激均可能导致外分泌腺腺体的损伤，从而导致其分泌功能的下降。

1 间充质干细胞

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）可在各种组织中形成异质性多能性基质细胞群，具有多向分化能力[1]，因此MSCs对组织损伤的修复作用已被广泛应用于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、心肌梗死、心肌瘢痕、肺损伤、软骨和骨骼损伤、皮肤和神经组织损伤等研究中[2-6]。MSCs可通过表面分子及功能特征的组合来识别，表达CD13、CD29/ITGB1、CD44、CD73、CD90、CD105 和 CD106/VCAM-1， 通常缺乏造血 表 面蛋白 CD31/PECAM-1、CD34、CD45/LCA 和 CD11b[6]。迄今为止，还没有一种独特的MSCs表面标志物被普遍应用于鉴定，还需以附加的功能特征来表征，如细胞呈纺锤样形态，黏附在塑性表面的能力及造血、成骨、成脂的分化潜能。即使通过高剂量的电离辐射后，MSCs形态仍保持稳定，分化潜能、细胞凋亡水平、黏附和迁移能力均不受明显影响[7-9]。

2 MSCs旁分泌作用

一般认为，MSCs发挥作用的机制为转分化、细胞融合、旁分泌效应、携带mRNA或miRNA和线粒体转移等。既往认为，干细胞主要作为种子细胞经移植后在体内分化为靶组织细胞，或与靶组织细胞发生融合从而达到修复的目的。但近年来的实验证实，成体干细胞植入缺血组织后并未分化成相应的心肌、内皮、肾小管上皮等靶组织细胞，而是通过促增殖、抗凋亡、抗炎等效应，显著改善了缺血后组织的功能[10-12]。MSCs被发现通过分泌细胞因子、生长因子和其他旁分泌因子，在损伤器官中形成具有支撑作用的微环境，进而支持其他类型细胞在病变组织中再生[6]。

MSCs的旁分泌效应，被认为是最全面和持久的作用模式。有研究认为，MSCs条件培养基（MSCs-CM）可刺激内皮细胞（ECs）和平滑肌细胞的生长，这种现象可通过MSCs-CM中检测到高水平的VEGF和bFGF来解释，但使用抗VEGF和抗bFGF抗体中和只能部分地削弱这种效应，表明除VEGF和bFGF外还有其他潜在的有益趋化因子或细胞因子需要确定，如免疫调节因子、抗炎抗凋亡及抗氧化因子等[5]。Selmani等[13]发现，由MSCs分泌的HLA-G5，可使MSCs对 T淋巴细胞和NK细胞具有免疫抑制作用。研究证明，MSCs可抑制树突细胞（DC）来源的CD14+单核细胞的分化、成熟及功能，从而抑制T淋巴细胞免疫应答；还可诱导CD4+CD25高表达，从而调节T细胞。除对淋巴细胞的影响外，MSCs的生物活性成分还可促进巨噬细胞从促炎表型M1（经典活化的巨噬细胞）转变为抗炎症表型M2（替代激活的巨噬细胞）[14-15]。为了防止程序性细胞凋亡，MSCs合成和分泌了经典的细胞凋亡抑制剂蛋白，如Bcl-2、survivin和Akt。MSCs除直接合成抑制细胞凋亡的蛋白外，还能分泌细胞因子，抑制凋亡途径或提高存活率（如VEGF可通过上调Bcl-2或通过抑制p53介导的细胞凋亡而起到抗凋亡的作用）[16]。当氧化反应旺盛时，会发生以下过程：炎症细胞浸润、蛋白酶的释放及ROS等氧化副产物的积累。而MSC衍生的Stanniocalcin（stc1）可减少ROS相关的细胞凋亡，表明其在抗氧化活性方面的作用[17-18]。

研究发现，间充质干细胞移植治疗存在一些安全隐患，如易成瘤、免疫抑制、植入率分化率低、血管栓塞等不良反应。另外，要获得足够的干细胞数量需进行传代培养，但干细胞多次传代后生物学特性可能会发生改变，出现干细胞老化、癌变等不良后果[19-21]。研究证实，MSCs衍生的条件培养基或外泌体在修复受损组织中具有抗炎和调节免疫的作用[22]。

MSCs-CM是MSCs在培养过程中产生的上清液，含丰富的生长因子、细胞因子、生物活性因子和组织再生剂等[23-24]。MSCs衍生的细胞外囊泡（EV），包括外泌体（Exosome）和微泡（MV），已被证明在MSC细胞疗法中的作用，这些囊泡参与细胞间的通讯、细胞信号传导以及改变细胞或组织的代谢[25-27]，MSC-Exo中的蛋白或RNA能调节细胞的增殖分化，并促进细胞归巢作用，从而促进损伤修复及组织再生[28-29]。与MSCs移植相比，MSCs-CM及外泌体更方便储存和运输，且避免了许多细胞移植的相关风险，更具安全性[29]。Damania等[30]证明，MSCs来源的外泌体对干细胞没有任何细胞毒性，减少了由于损伤条件而产生的氧化应激，同时显示出更好的细胞保护性及细胞活性。MSC-Exosome在骨损伤、皮肤损伤、神经损伤及肝损伤等的修复上都具有积极的作用[31]。

在局部损伤、炎症、缺氧等刺激的诱导下，可促进MSCs旁分泌因子的释放。王丹等[32]证实了辐射预处理MSCs可以破坏其分化能力，但保留旁分泌能力，当＜4 Gy剂量的60Co γ射线辐射后VEGF及bFGF水平无明显降低，与未经辐射的对照组相比无明显统计学差异，而≥4 Gy剂量辐射后 MSCs的Ⅷ因子阳性率显著降低，说明其分化能力受损。该实验证明4 Gy剂量的60Co γ射线既不影响 MSCs的旁分泌功能，同时又能抑制其分化能力，为后期研究MSCs的旁分泌实验细胞模型的建立提供一个新思路。

3 MSCs旁分泌在外分泌腺损伤中的作用

3.1 唾液腺损伤

大约有70%接受头颈部放疗的患者因主要的几个大唾液腺靠近肿瘤原发灶和淋巴结位点经常被照射，导致唾液腺功能逐渐丧失，从而直接或间接影响患者的生活质量。并发症包括味觉丧失、灼口症、龋齿和其他口腔传染病，以及吞咽困难、发音障碍，甚至导致心理疾病。改进放疗技术、放疗前转移颌下腺，以及促涎剂的使用等仍无法实现对唾液腺功能长效的改善[33-34]。

头颈部放疗通常会导致唾液腺发生不可逆性的损伤。Stiubea-Cohen等[35]证实，在辐射后12周，唾液分泌逐渐减少到初始水平的50%，通过蛋白质组学质谱（MS）分析后进一步检测了唾液蛋白质组合物，结果显示来自下颌下腺（SSG）的蛋白质表达减少，而来自血清的蛋白质表达增加，两者均提示唾液腺组织的损伤。为了检查mRNA表达水平的变化，进行了微阵列分析，发现95个基因有着显著变化，包括细胞周期阻滞基因、SG功能基因和DNA修复基因等。

Shin等[36]将人腮腺上皮细胞与hADMSC进行3D共培养。结果表明，低氧预处理hADMSCs保护唾液腺免受辐射诱导的细胞凋亡，并通过hADMSC旁分泌因子（包括FGF10）的作用激活FGFR-PI3K信号来保持腺泡结构和功能。An等[37]将hADMSC分离、扩增并暴露于低氧条件下（O2＜5%），将缺氧条件培养基过滤至高分子量级，并制备成hADMSC分泌物。实验证实，条件性hADMSC分泌物含有高水平的GM-CSF、VEGF、IL-6和IGF-1，与对照组相比，用 hAdMSC分泌物重复输注，唾液分泌能力增强，同时唾液蛋白（包括淀粉酶和EGF）的水平增加，且SG的显微结构完整性得以保存，并保护唾液上皮（AQP-5）、内皮（CD31）、肌上皮（α-SMA）和 SG祖细胞（c-Kit）免受辐射损伤。同时，实验还证明缺氧预处理可促进hADMSC的抗凋亡作用。

3.2 汗腺、皮脂腺损伤

研究认为，MSCs介导的伤口愈合涉及多种机制，包括抗炎、抗菌、免疫调节和组织修复活动[38]。皮肤及其附属器（如毛囊、皮脂腺、汗腺）在皮肤的基本功能中发挥着重要的作用，如热调节、感觉和润滑等，由于受伤或烧伤可能会导致局部或全层的损伤。在全层皮肤缺损的情况下，汗腺及皮脂腺不可再生，导致分泌功能丧失。皮肤再生是一个动态且复杂的过程，需要一系列涉及表皮细胞、皮肤细胞、生长因子、细胞外基质（ECM）、受损部位神经、血管的协调相互作用。Wu等[29]证实，MSC-Exosomes能够通过传递Wnt4及转运Wnt11来激活皮肤细胞中Wnt/β-catenin途径，以促进皮肤伤口愈合并在损伤后恢复皮肤完整性。Padeta等[39]利用MSC-CM在背部烧伤大鼠模型中进行局部治疗，结果显示MSC-CM可促进大鼠皮肤烧伤创面的恢复。

李倩坤等[40]利用定量紫外线照射人永生化表皮细胞（Ha-CaT）构建表皮细胞光老化模型，培养人绒毛膜间充质干细胞（CDSCs），将不同浓度的 CDSCs上清液（CDSC-CNM）作用于光老化表皮细胞，结果显示CDSC-CNM对光老化表皮细胞有修复再生作用，可有效增强细胞活力、减少ROS生成量，并减轻DNA损伤程度，有望用于治疗大面积汗腺损伤患者。

3.3 胰腺、肠损伤

放射治疗在恶性骨盆肿瘤中具有至关重要的作用，肠对放射线非常敏感，接受放疗的腹部恶性肿瘤患者（10%～20%）在治疗结束后数年发生肠道并发症，辐射产生自由基，通过直接和间接的作用，诱导隐窝细胞的凋亡，导致黏膜损伤并丧失上皮屏障能力。动物模型实验已证明，静脉内（IV）注射MSC可减少由电离辐射引起的严重的结直肠损伤，IV-MSC治疗促进了上皮再生从而使肠组织结构改善，同时限制纤维化过程[41-43]。

刘婉薇等[44]通过炎症预激活BMSCs条件培养基对急性辐射损伤小肠上皮进行治疗，结果表明炎症激活状态下的BMSCs条件培养基可促进辐射损伤小肠结构和功能的修复。郑跃等[45]通过缺氧诱导也得到相同结论。Pouya等[46]将MSCCM注射小鼠急性结肠炎模型，发现小鼠体重减轻症状缓解、血便减少、大便黏稠度改善，发现其上皮细胞损伤、杯状细胞破坏、弥漫性纤维化、隐窝破坏和炎症细胞浸润显著减轻。刘敏等[47]将MSCs培养上清作用于急性胰腺炎大鼠模型，显示其胰腺组织病理损伤减轻，IL-6及TNF-a水平明显减低。

3.4 肝脏损伤

肝脏具有强大的自我修复和再生能力，该特性使肝脏免受食物毒素引起的毁灭性的肝脏损伤，但发生急性肝功能衰竭（ALF）时，常导致患者死亡。肝移植是首选治疗方法，但存在器官捐献者短缺、费用昂贵、伦理学限制、需长期服用免疫抑制剂等问题，这使得干细胞移植成为治疗该疾病的新希望[48]。

Xu等[49]的研究表明，MSC-CM可通过抑制细胞凋亡和调节miRNA表达，从而减轻H2O2诱导的氧化应激肝损伤。此外，miR143的下调可保护人类肝细胞系L02细胞免于凋亡，并通过调节HK2 ADRB1和凋亡相关蛋白的表达启动抗凋亡过程。Chen等[50]在MSC-CM修复辐射性肝损伤的体内及体外实验中，观察到MSC-CM抑制辐射诱导的SD大鼠肝窦状内皮细胞（Sinusoidal endothelial cell，SEC）凋亡，肝组织切片显示MSC-CM预处理组的窦性充血和脂肪变性显著减少，血清透明质酸 （Hyaluronic acid，HA） 显著下降，TNF-α、IL-1β和IL-6的表达降低而IL-10的表达增加。总之，MSC-CM治疗对SEC凋亡和炎症反应调节具有显著的抑制作用，最终改善经受辐射诱导的大鼠肝损伤。Damania等[30]利用富含外泌体的分级分泌蛋白质组修复肝损伤的体外模型，结果证实外泌体的抗凋亡/促存活及抗氧化等作用，临床可用于肝移植病例以减少缺血/再灌注损伤相关的组织损伤或用于治疗急性肝衰竭。

4 展望

MSCs作为一种来源丰富的种子细胞，在外分泌腺的损伤修复中发挥着巨大的作用，研究证实旁分泌作用是其主要的修复机制，未来或许可以利用条件培养基或外泌体等代替细胞对外分泌腺损伤进行修复，并可进行大批量、标准化生产。随着组织工程的发展及研究的深入，间充质干细胞的旁分泌作用会在外分泌腺损伤修复方面占据更重要的地位。