3D生物打印复层空腔组织的初步研究

皮庆猛 王晓磊 张志亮 周碧玉 任晓芸 陆毅 黄一雄 傅敏刚 范志宏

硬材料3D打印已经展现了广泛的研究和应用价值，但是生物打印的研究尚处在早期阶段。为实现具有功能的生物活性组织的精确打印，理想的可打印生物材料应具有良好的生物相容性、支架结构具备良好孔隙率，并兼有降解性及快速可塑性[1-3]。由于可打印生物材料的限制，利用生物打印技术，快速构建复杂空腔组织或器官尚面临巨大挑战。

目前，较常用的可生物打印材料主要为水凝胶成分，一般是借助交联的方法实现打印过程中由液相向固相转变，即凝胶化[4]。甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）是一种明胶衍生物，经化学修饰后，可经UV照射快速交联形成网状结构[5]。文献报道GelMA 5%（m/v）～10%（m/v）交联后具有良好的细胞相容性，同时具有一定的打印可塑性[6]。海藻酸盐（Alginate）具有Ca2+快速交联的特性，但细胞在该种水凝胶里生长缓慢，伸展受限，浓度越高越不利于细胞生长[7]。在生物打印时一般将其浓度控制在1%（m/v）～2%（m/v）。

我们的前期研究证实，利用复合水凝胶可同时打印含有血管内皮细胞和BMSC的单层管状结构，打印后结构可实现灌注功能，细胞-支架复合物在体外可长期存活，并能在结构内铺展[8]。本实验以GelMA和Alginate为打印生物墨水，采用离子交联（Ca2+）和光交联快速分步固化的方法，探讨3D生物打印具有亚层次结构的复合空腔管状组织的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

猪源明胶（Gelatine，type-A，300 bloom）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic Anhydride，MW=154.16 KDa）、海藻酸盐（Sodium alginate，MW=33 KDa，low viscosity）、氯化钙、EDTA等购自Sigma公司。胎牛血清、PBS、HEPES缓冲液、0.25%胰酶、高糖基础培养液DMEM等购自Gibico公司。细胞活力检测（Live/dead）试剂盒、细胞增殖能力检测试剂盒（Prestoblue）、细胞骨架蛋白 F-actin（Alexa-594、Alexa-488）、细胞核染料DAPI、Celltracker（绿、红）、Microbeads（绿、红）等购自Life Technologies公司。

Instron生物力学检测仪 （Model5542，美国），RHEOPLUS-32 流变仪（Anton Paar，德国），3D 生物打印机 NovoGen MMX bioprinter（Organovo，美国），多通道打印喷头由本实验室自行组装。

1.2 实验方法

1.2.1 复合水凝胶制备

①制备GelMA：猪源明胶10 g，溶于无菌100 mL PBS中搅拌，240 r/min、50℃恒温溶解1 h；缓慢加入1.25 mL甲基丙烯酸酐，240 r/min、50℃恒温溶解2 h；加入100 mL PBS稀释混匀，转入滤膜搅拌透析5～7 d，40 ℃、500 r/min，每日更换透析液（去离子水）2次；透析结束后，无菌滤网（Millipore）过滤，分装至50 mL离心管，-80℃冷冻存放2～3 d；依次冻干机冻干5～7 d，室温存放备用。②基础工作液：200 mL灭菌水加入10%FBS，缓冲液HEPES调整pH值至7.4。 ③称取GelMA 7%（w/v）分别与 1%、2%、3%（w/v）的Alginate，两两混合溶于基础工作液，进行分组实验，即：GA1、GA2、GA3，单纯 GelMA 和 Alginate 组为对照组。④轻微震动、加热摇匀5 min后，放置37℃培养箱备用。

1.2.2 生物力学检测

①制备PDMS模具：将PDMS液相A/B剂按照10∶1配比，80℃烤箱烘干固化1 h，做成直径1 cm、高度0.8 mm的圆柱状孔型模具。75%乙醇浸泡消毒30 min，备用。②无菌3%CaCl2200 μL滴入孔中浸润覆盖底部，备用。③将不同配比的复合水凝胶（GA1，GA2，GA3，GelMA 和 Alginate 五组）， 分别滴加入孔中，表面与孔周平面平齐。④表面再次滴加3%CaCl2200 μL，交联后备用；每组4个样本。⑤样本放入UV灯下8 cm处，波长360～480 nm，6.9 mw/cm2交联30 sec。⑥将样本逐一放入Instron生物力学检测台上，以1 mm/min 60%的力压缩样本，采用Bluehill软件分析记录压缩距离compression（mm）和压力load（N），取曲线0%～10%的形变区间计算杨氏模量。

1.2.3 打印可塑性检测

①将不同复合水凝胶分别均分为2份，加入绿色（内层）和红色（外层）颜料Microbeads，振动混匀，分别移入两支3 mL注射器，并固定于打印机器NovoGen MMX bioprinter的助推泵上。②将绿色管与红色管与多通道打印喷头分别以软管链接，以打印不同层次，以heater维持周围温度。③3%CaCl2同样注射器吸取3 mL后，连接打印喷头并固定。④通过调节打印喷头行进速度及不同通道间的推进流速，以打印出稳定的空心管结构。⑤将打印出的空心结构，取横断面置于荧光显微镜下观察，以确定具有内、外双层结构。

1.2.4 复层管腔组织打印

①无菌复合水凝胶G7A2两份各3 mL，置37℃培养箱备用。②取状态良好的小鼠成纤维细胞3T3，分为两组，分别用绿色、红色Celltracker标记，并调整细胞数量为2×106个，消化离心后，去上清，保留细胞团块，备用。③分别用复合水凝胶液重悬细胞团块，轻轻混匀，移入注射器内，并固定于打印机推进泵上，连接软管。④以无菌3%CaCl2注射器吸取3 mL后，连接打印喷头并固定。⑤调整打印喷头速度及推进速度，以打印出复层结构管状组织。加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，每3日换液。⑥分别在第 1、3、7、10、14 和 21 天，取样本组织块，以 live/dead试剂盒检测细胞活力。⑦不同时间点取样本，将标记后的样本于倒置荧光显微镜下观察，不同视野随机取3个区域，拍照。⑧分析比较各组在不同时间点细胞活力的差异。

1.2.5 打印后复层管腔组织灌注实验

①含有内外复层3T的管状打印方法同前。②将打印后复层管状组织用含10%胎牛血清的DMEM培养液体外培养24 h。③用27G针头，固定打印复层管一端，用含有红色荧光的灌注液，持续灌注复层管状组织。④荧光紫外灯照射下，视频记录灌注情况。

2 结果

2.1 复层空腔组织打印策略

理想的可打印生物水凝胶材料是实现复杂组织构建的关键因素。据文献报道，海藻酸盐可以通过离子键（Ca2＋）快速交联固化，具有良好的快速打印塑型的能力，但是该种水凝胶材料不利于细胞在其内长期生长和铺展。而明胶衍生物GelMA具有良好的细胞相容性，被化学修饰后加上了光敏的酸酐键，经紫外光交联后可彼此形成共价键，从而凝胶固化，但是其力学性能不够。本实验结合两种水凝胶的优劣，我们先将复合水凝胶通过离子交联塑型，再光交联固化GelMA，从而实现在3D生物打印的过程中快速构建管状结构的目的（图1A-B）。

复杂的空腔组织或器官往往具有两种或以上的亚层次结构，为了实现不同亚层的差异化构建，我们设计了一种同轴多通道生物打印系统（图1B）。将不同的亚层组织细胞类型，跟相应的细胞外基质混合，利用该系统分别将不同层面同时打印，一次性构建两种或以上的复层管状结构（图1C）。

2.2 复合水凝胶力学性能

为了实现打印过程中快速交联固化，我们采用本实验室制备的GelMA[9]，打印过程中我们选择GelMA的浓度为7%[8]。为了增加空腔管腔结构的力学强度，我们根据文献报道，将不同浓度（1%、2%、3%）的Alginate分别与7%GelMA混合，力学测试结果显示，复合水凝胶杨氏模量为（8.78±1.73）×10-3MPa，较单纯 GelMA 的杨氏模量（2.38±0.69）×10-3MPa和单纯海藻酸盐的杨氏模量（0.83±0.24）×10-3MPa，有明显统计学差异（图2A）。复合水凝胶的力学强度明显高于单纯对照组，随着海藻酸盐浓度从1%增加到3%，复合水凝胶的力学强度也相应增加（图2B）。这提示两次交联后，组织硬度明显增加。但是，组织结构过硬，不利于细胞在结构内铺展生长。因此我们将海藻酸盐的浓度控制在3%以下，在保证可打印的前提下尽量降低海藻酸盐的浓度。

2.3 打印可塑性

新型设计的同轴多通道生物打印系统，利用不同的通道分开，同步打印不同的管状结构的亚层，通过颜色区分标记。我们发现，打印后的复层管状结构，不同层次间具有明显区分（图3A-C）。内、外层结构内的颜色标记，经两次交联后并没有相互渗入或混合，这说明两层结构是完全独立的，理论上可以实现解剖剥离。

通过显微镜下定量测量，内、外层管壁的厚度为（62.06±0.45） μm 和（93.78±10.25） μm，提示每层结构可具有人体1～2个细胞的厚度。内、外管的管径分别为（663.66±51.74） μm 和（976.84±63.44） μm，与人体内微动脉、尿道或输尿管等内径相当，说明通过多通道共轴打印系统可独立同步构建复层管状结构。

2.4 复层管腔组织打印

为明确细胞对于复合水凝胶的相容性，将同等数量的小鼠成纤维3T3细胞，与含有不同浓度海藻酸盐的复合水凝胶及单纯GelMA和海藻酸盐混匀，利用同轴多通道系统生物打印，依次快速离子交联和光交联。第 1、3、7 天细胞活力分别为（88.50%±5.8%）、（85.57%±6.22%）和（96.29%±2.64%）（图 4A-E）。我们观察到，细胞经过长时间的打印过程，打印通道会对细胞造成一定损害，打印第3天的细胞活力比打印即刻或第一天的活力有所降低，而对于这一现象，有文献解释为打印后细胞部分失活坏死造成，这与我们观察到的结果基本一致。

为了便于观察不同层次间细胞是否会相互渗透，我们打印前将内、外层细胞分别用绿色和红色的细胞示踪剂予以标记。打印后4天d，我们发现绿色荧光信号只分布在内层，而红色荧光信号只分布在外层（图4F-G）。这说明该同轴多通道生物打印系统可同时打印出复层空腔管状结构的不同组织层次，而不同层次的细胞间可在短期内滞留在相应的组织层次内。

2.5 打印复层管腔结构的灌注功能

图1 复层管状结构水凝胶打印策略模式图Fig.1 Design of hydrogel 3D bioprinted hollow structure with multiple layers

为了检测管状组织是否具有灌注功能，我们于打印第一天，将含有3T3细胞的复层管状组织，链接27G注射器针头，持续灌注含有颜料的溶液，不同时间点在荧光下拍照、录像。实验发现，复层管状组织内，有色颜料溶液并没有渗出到管壁外侧，这说明含有双层细胞的管状结构的组织管壁完整性良好，能够实现灌注功能（图5）。

图2 复合水凝胶力学检测Fig.2 Mechanical test of blend hydrogels

图3 复层管状结构打印Fig.3 Printing of double-layer structure

图4 复层管状组织打印Fig.4 Bioprinting of hollow tissue with double-layer loading with cells

图5 复层管状组织灌注实验（Bar=1 cm）Fig.5 Perfusion test of printed tissue with microbeads(Bar=1 cm)

3 讨论

3D打印在医学领域已经展现了广泛的应用价值，如3D打印的人工关节、耳蜗、复杂骨缺损替代物等。但是，3D生物打印尚处在早期研究阶段[10]。目前，3D生物打印构建单一实体组织的研究已有报道，如心肌、软骨、皮肤等[11]。但是，对于空腔管状组织的生物打印，特别是打印复杂的、具有不同亚层次结构的空腔管状组织或器官尚无成功的报道。

理想的水凝胶是构建复杂空腔组织的关键因素。本实验利用海藻酸盐可被Ca2＋快速交联和GelMA被光照射快速交联的特性，初步探讨了构建复层空腔组织的可行性。本实验在生物打印过程中，首先利用CaCl2快速固化复合水凝胶中的海藻酸盐以初步塑型水凝胶，形成空腔结构，而后利用UV照射交联GelMA，EDTA洗掉海藻酸盐后留下GelMA作为细胞支架材料复合物。通过两次快速交联固化水凝胶，可增加一定的力学强度，以达到生物打印后快速构建复杂管腔结构的目的。实验中，我们证实复合水凝胶可以同时同步一次性打印出具有不同层次的复层管状结构，而两层亚结构内水凝胶或细胞均固化良好，短期内不会相互渗透。

细胞与材料具有良好的生物相容性，是构建具有生物功能的组织或器官的另一关键因素。增加海藻酸盐的浓度，将更有利于打印的快速塑形，但是高浓度的海藻酸盐不利于细胞生长。实验中，我们将海藻酸盐的浓度控制在3%以下，而GelMA控制在5%以上，细胞的活力在打印后可维持在85%以上。但是，由于打印过程对细胞的剪切、挤压等因素，使得打印后细胞活力在第2～3天有明显的降低，该现象与文献报道基本一致[12]。而短期内含有细胞的复层管状结构具有良好的灌注功能，注射的含有颜色的溶液，可以快速通过管腔结构，但没有渗出到管壁外侧。然而，实验发现，长期培养（2周以上）时打印的组织形态难以维持，力学强度非常差，理想的打印材料还需要进一步探索。

综上所述，本实验初步证实，利用GelMA和海藻酸盐复合的水凝胶可快速打印具有复层结构的空腔管状结构，所打印细胞具有良好的活性。该结果为构建复杂空腔组织或器官提供了借鉴，但仍有待于进一步的探索。