P2X配体门控离子通道7基因多态性在痛风发病机制中的作用

李曼云，陶金辉，李向培

Fundprogram:National Nature Science Foundation of China(81671601)

痛风是一组嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少使血尿酸持续升高而导致尿酸盐结晶(monoso-dium urate，MSU) 析出并沉积在关节或关节周围组织中引起关节肿痛的炎性反应性疾病，临床特点为高尿酸血症及急性痛风性关节炎反复发作，痛风石沉积，慢性痛风关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。据中国疾病预防控制中心测算，目前我国高尿酸血症患者超过1.2亿，并以每年超过10%的速度迅速增加，已成为严重危害人类身体健康的常见病。因此深入了解痛风性关节炎的发病机制对延缓和控制疾病的发展具有重要的意义。流行病学研究表明，只有10%的高尿酸血症人群会患痛风，表明除了代谢因素外，痛风的发生还有其他因素。现有研究表明：高尿酸血症可导致MSU晶体的形成，它通过活化的toll样受体(toll-like receptors，TLR)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体3[nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3]炎性小体参与信号转导产生IL-1β，导致急性痛风性关节炎的发生。有研究表明，除体内的MSU晶体诱导刺激NLRP3炎性小体生成以外，胞外ATP的变化可以通过刺激嘌呤受体P2X配体门控离子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7R)信号通路，协同MSU晶体刺激产生NLRP3炎性小体。ATP作为痛风发作的第二信号，通过P2X7R信号通路起作用，因此P2X7R的功能状态决定了ATP能否诱导急性痛风性关节炎的发作[1]。人类 P2X7R 基因上存在许多单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，这些 SNP 位点可以通过影响 P2X7R 膜孔形成能力，从而影响K+外流速度，改变P2X7R 的功能状态。本文对与痛风P2X7R基因多态性相关联的进展进行综述。

1 P2X7R的结构和功能

P2X7R是P2X家族的重要成员，人类P2X7R位于12号染色体的长臂上，处于12q24.31的中央位置，由595个氨基酸(P2X7亚基或单体)组装成一个三聚体，形成功能性的P2X7R。P2X7R在多种炎性反应性疾病中都起着重要的作用，如多发性硬化[2]。P2X7R在调节核苷酸的促炎作用上发挥了重要的作用，在急性或慢性炎性反应中，它在血管壁细胞的各种功能中均起着至关重要的作用。它的独特功能主要体现在高浓度ATP的刺激下，P2X7R上可以形成非选择性阳离子通道或膜孔隙，在巨噬细胞中足以允许相对分子质量(Mr)为900 000的亲水性溶质分子通过此孔隙[3]。此外，由P2X7R介导的IL-1β释放除了在痛风性关节炎中起重要作用，还在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、B16黑色素瘤或CT26结肠癌肿瘤等疾病中具有重要的炎性反应性作用[4-6]。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)存在于人体的每个组织细胞内。而在细胞表面的嘌呤能受体中有4个G蛋白偶联的腺苷受体，分为P1嘌呤能受体和P2(P2 receptor，P2Rs)嘌呤能受体。其中，P2受体分为P2X和P2Y，当渗透压发生变化时，P2嘌呤能受体可以通过细胞表面膜通道(主要是泛连接蛋白-1，pannexin-1)将胞内ATP释放到胞外。参与固有免疫反应的P2R主要是P2X7R受体，它在参与先天性和适应性固有免疫反应的所有细胞中表达。对载脂蛋白(apolipoprotein，APO)和ATP结合的晶体结构的比较表明了通道开启的机制：P2X7R与ATP的结合引起了构象上的重组，即P2X7R与ATP的结合导致了ATP单体的重新组合，形成了所谓的细胞质帽，在结构上，细胞质帽的二级结构，包括两个序列，分别为来自N端的β-链和来自C终端的β-链。细胞质帽的三级结构由三层β-链组成的网状结构定义，它位于跨膜域之下，覆盖了细胞质表面的孔隙，N端的β-链和C端的β-链相互结合形成了小的β-膜。在功能上，细胞质帽仅可在与ATP结合的开放性结构中观察到，这表明在APO存在的状态下，构成细胞质帽的元素是灵活而无序的[7]。从对人类和老鼠P2X7R的电生理学分析可得知：大的有机阳离子的渗透性是P2X7R通道的固有特性，从而不需要渐进的孔隙扩张达到阳离子的渗透。然而，P2X7R尾扩展的C-末端是保证大孔隙渗透率增加的绝对要求[8]。螺距的改变使与通道开启和脱敏相关的跨膜螺旋体2(transmembrane helix 2，TM2)发生旋转。细胞质帽的形成固定了TM2的细胞质部分，迫使螺旋延伸成的构象从而稳定了孔隙的开放。在这过程中，需要P2X7R的C-末端支持TM2的螺旋运动产生大的孔隙，以稳定由N和C终端之间的相互作用形成的细胞质帽，或者保证允许通过P2X7R通道的最大离子渗透性。当通道处于开放状态时，改变N和C终端相互作用的方向，使得Na+和Ca2+快速通过和K+快速流出细胞膜[7]。

2 与分泌IL-1β有关P2X7R的SNP

IL-1β在损伤、感染和免疫反应中都扮演着重要的角色，同时也是造成急性和慢性炎性反应的重要枢纽。有研究发现，由脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)刺激P2X7R缺陷型小鼠，小鼠体内的IL-1β分泌水平降低， P2X7R缺陷小鼠与野生型小鼠相比，P2X7R缺陷小鼠的血清IL-1β水平更低。提示P2X7R的存在，对IL-1β的分泌起着重要的作用[9]。由几个上游信号共同激活了NLRP3，包括细胞内K+浓度的改变，细胞膜上非特异性膜孔隙的形成，溶酶体损伤，线粒体损伤，活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，细胞体积的变化，以及Ca2+信号等。而这一过程是由ATP渗透到细胞膜上，当相对分子质量达到900时，可以损害溶酶体和线粒体，从而增加ROS的量[10]。巨噬细胞中产生的炎性小体，一旦形成，会使NLRP3炎性小体复合物(NLRP3-ACS-NEK7-caspase-1)被激活，前体IL-1β和前体IL-18将会分别变成IL-1β和IL-18，促进炎性细胞因子的分泌。在产生IL-1β的过程中，细胞内K+浓度的耗竭是激活NLRP3的扳机点，而对钾的抑制则阻止了在对MSU反应中NLRP3依赖的caspase-1的激活，从而对IL-1β的产生起了关键的作用。现已知有几种微生物毒素会引起炎性反应，从而导致细胞内K+的耗竭，因此体内阳离子的波动可能是一种病原体存在对免疫细胞的普遍警醒机制。另外，在编码区发现，P2X7R的SNPs可能会影响IL-1β的表达。有研究表明，P2X7R的SNPs与IL-1β的分泌能力有关，而不同部位的SNPs对IL-1β分泌的影响也各不相同。1068 G>A(Ala-348-Thr)的SNP能够增强P2X7受体分泌IL-1β的能力[11]；489 C>T(His-155-Tyr)的SNP对编码P2X7R具有很高的亲和力,并且很有可能增强了P2X7R单体的聚合[12]。1513 A>C(Glu-496-Ala)的SNP是P2X7R中的一个关键部位，它影响了锚蛋白重复序列模体的胞内 C-端尾巴，而这个关键区域与 P2X7 受体功能是相关的，从而减少了由P2X7R介导的K+外流的效应，进而影响由ATP诱导的在单核细胞中释放的IL-1β[13]；1096 C>G(Thr-357-Ser)的SNP能够降低P2X7R分泌IL-1β的能力。

3 原发性痛风和高尿酸血症患者P2X7R基因多态性发生频率和差异

3.1 与痛风发病相关的常见P2X7R基因多态性和发生频率

在全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)中发现了SNPs与原发性痛风和高尿酸血症之间的关系。许多研究表明，P2X7R的基因多态性可能会影响IL-1β的分泌，因此在原发性痛风的发病机制中起着至关重要的作用。目前发现；痛风的P2X7R位点有13个。除了涉及到的几种最常见的SNP，包括：rs2230911、rs3751143、rs208294、rs1718119，最新的研究还发现了与P2X7R基因多态性和原发性痛风和高尿酸血症之间的基因联系，共9个位点，分别是：rs435309、rs28360447、s28360457、rs1653624、rs10160951、rs17525809、rs7958316、rs2230912、rs1621388[14-16]。Ying等[16]在对中国汉族男性人群P2RX7基因多态性与原发性痛风和高尿酸血症相关性的研究中发现：rs2230911的基因型在原发性痛风患者和正常人(尿酸值正常设为正常对照组)发生的频率有显著的不同，等位基因G的发生频率在原发性痛风更高[OR(95%CI)=1.755(1.278，2.410)];而在原发性痛风患者和高尿酸血症患者之间，没有显著的差异[P=0.121;OR(95%CI)=1.438(1.002，2.064)，P=0.048],对主要模型的分析发现，原发性痛风患者的基因型(CG+GG)发生频率高于基因型CC[OR(95%CI)=1.876(1.303，2.701)，P=0.001]。进而表明：P2X7R的rs2230911可能与中国汉族男性主要导致痛风的风险因素有关，而G型等位基因可能是引起原发性痛风的主要易感因素[17]。这项研究还发现：rs208294(His 155 Tyr，H155Y或489T→C)影响了受体的胞外域，并通过使155位点的His突变成Tyr，促进了P2X7R单体的组装。Portales-Cervantes等[18]研究发现：C等位基因的发生频率是40.1%，而正常对照组C等位基因的发生频率是45.7%，表明rs435309(rs1752809， Ala，253T→C)突变会导致P2X7受体功能严重受损。另外，Ying等[16]还发现：对rs28360447, rs1718119, rs28360457和rs3751143这4个基因用哈迪-温伯格平衡定律(hardy-weinberg equilibrium, HWE)进行P值计算，结果P值均<0.05，意味着这些值不能满足连锁不平衡分析的假设，表明在这项研究中，计算这些基因的SNP和原发性痛风之间的关系无统计学意义。对韩国男性人群的研究显示，P2X7R的 rs3751142和CARD8的rs2043211多态性与痛风的发展没有关联。其中，在痛风和正常对照组之间未发现rs3751142(C>A)和rs2043211(A>T)的等位基因和基因型的频率差异，但是通过对P2X7R的rs3751142和CARD8的rs2043211基因组合在一起进行比较得出结论：与CC/AA组相比，CARD8的rs2043211中TT的隐性纯合子和P2X7R的rs3751142中CA的杂合子组合更易患痛风[19]。

3.2 与痛风有关联的其他基因多态性

有研究最近发现了一些与痛风有关联的风险因素，在GWAS仅由临床定义的日本男性痛风病例中，16个SNPs与痛风有关，并且在已发现的5个痛风风险位点中包括了两个新的位点，分别是MYL2-CUX2和CNIH-2[20]。通过对GWAS和所有痛风病例的研究，一项Meta分析筛选了8个基因位点，为GWAS的关联研究提供了新的证据，分别是：ABCG2基因rs3114020，SLC2A9基因rs1014290，CUX2基因rs4766566，SLC22A12基因rs2285340，GCKR基因rs1260326， SLC17A1基因rs1165176，HIST1H2BF-HIST1H4E基因rs11758351, CNIH-2基因rs4073582。在这8个位点中，SLC22A12、SLC17A1和HIST1H2BF- HIST1H4E是全基因组级别上与GWAS最为接近的首先识别为痛风风险因素的3个位点，其中在GWAS上最先识别了SLC17A1。Hollis-Moffatt等[21]报道：rs1183201(除了SLC17A1)，其他SNPs在欧洲人和波利尼西亚人的候选基因中均有关联。在这8个位点中，SLC22A12上的rs2285340位点主要编码肾脏尿酸重吸收转运体，参与尿酸盐的重吸收。HIST1H2BF和HIST1H4E分别表达H2bf和组蛋白1 H4e，结合DNA形成核染色质的结构。该位点功能的SNPs可能影响染色质结构的稳定性，改变细胞周期、细胞数量或对炎性反应的反应，从而改变肾和/或肠内组蛋白的表达水平。在GWAS上，针对痛风的亚型，分为肾性尿酸排泄增多性痛风(renal overload，ROL)和肾性尿酸排泄减少性痛风(renal underexcretion，RUE)。ROL包括4个位点，分别是：ABCG2基因rs2728104，CUX2基因rs4766566，SLC2A9基因rs3733589，GCKR基因rs1260326。RUE包括7个位点，分别是：SLC2A9基因rs1014290，ABCG2基因rs1871744，CUX2基因rs4766566，SLC22A12基因rs2285340，GCKR基因rs780094, NIPAL1基因rs11733284，FAM35A基因rs7903456。不同位点在不同的人群中也有差异。值得注意的是，NIPAL1和FAM35A是在GWAS上RUE的最新亚型。NIPAL1作为镁离子转运体，由9个膜受体介导，但有最近研究表明其并非尿酸盐转运体，可能与尿酸盐的运输动力学的间接调节有关。最近有研究仍然揭示了高尿酸血症和镁的摄入，血清Mg2+水平和Mg2+排泄之间的联系[22-24]。GWAS发现FAM35A与欧洲人、波利尼西亚人、日本人3种人群的痛风均有关联，但机制尚不清楚。

4 结语

随着人类生活方式的改变，痛风的发病率逐年增高，严重影响了当今人类的生活质量，研究痛风和高尿酸血症有关的SNPs，可以对痛风易感人群进行早期筛查以及早期预防，并进一步针对这些基因位点，探索新的治疗方法，为痛风及其关联疾病的研究开启新的思路。因此，探索新的与痛风发病有关的SNP并针对性的应用于易感人群，值得进一步深入研究。