蛋白基因产物9.5 (PGP 9.5)在椎间盘源性腰痛的应用研究进展

张 静 贾家猛 何江涛

（川北医学院附属医院脊柱外科，南充637000）

椎间盘源性腰痛 (discogenic back pain) 是指椎间盘退变、纤维环内破裂、椎间盘内炎症等刺激椎间盘内疼痛感受器引起的腰痛，而无根性症状，无神经根受压或椎体过度移位[1]。一般认为成人健康的椎间盘是人体最大的无神经支配的组织。目前研究表明椎间盘中央部分没有神经末梢存在，仅在和毛细血管相邻的纤维环外层区域有很少的免疫组化可以检测到的神经纤维。但在椎间盘退变过程中有感知疼痛的神经纤维和血管向内生长进入椎间盘纤维环内层区域，这种神经内生长的机制目前尚不完全清楚，这可能是椎间盘源性腰痛发病机制潜在因素之一。蛋白基因产物9.5 (protein gene product 9.5,PGP 9.5)，是一种神经纤维中的特异性泛素羟基水解酶, 1983年 Doran等[2]通过高分辨率双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法从人脑组织中分离出蛋白基因产物9.5, 因其等电点为9. 5而得名 。它是一种分子量为27 kDa的蛋白质, 由 212个氨基酸组成的胞浆蛋白。PGP 9.5存在所有传入和传出神经纤维中，是一个非常好的泛神经标记物，对神经纤维特异性强，作为一种神经轴突标记物, 抗PGP 9.5抗体可以与任何无髓或有髓的神经纤维相结合，使用免疫荧光或免疫组织化学的方法即可标记出组织中PGP 9.5阳性的神经纤维。

一、PGP 9.5作为神经纤维标记物的应用

Wilson等[3]在使用兔多克隆抗体和小鼠单克隆抗体定位PGP 9.5时发现具有免疫活性的PGP 9.5在各级中枢和外周神经系统的神经元和神经纤维中都有表达，且用多克隆抗体的标准免疫组化技术可以清晰的显示直径大小不同的神经纤维。McArthur等[4]利用抗蛋白基因产物9.5检测小无髓鞘神经纤维来定量人类表皮神经纤维密度同样取得满意的效果。周重建等[5]采用免疫组织化学方法和激光共聚焦 (Confocal laser scaning microscopy) 技术, 使用多克隆蛋白基因产物9.5 (PGP 9.5)作为神经原标记物,观察大鼠腰5神经根受压后不同时期比目鱼肌中运动终板区域内的神经末梢再生状况。在该实验中，PGP 9.5免疫组织化学标记结合激光共聚焦在正常与再生的神经肌肉接合部，能清晰地显示精致的神经末梢，因此，PGP 9.5抗体可作为各种不同情况下肌肉神经支配、神经再支配和神经再生的重要研究工具。刘永丹等[6]在对正常人表皮神经形态计量学研究中，以PGP 9.5为特异性轴突标记物进行免疫组织化学染色，发现皮肤神经以及触觉小体对抗PGP 9.5免疫反应性好，且可以观察表皮内神经纤维(Epidermal, IENFs)的走形甚至分支。Fields等[7]在研究腰椎终板与椎间盘的神经分布时也用PGP 9.5作为神经纤维标记物。相比降钙素基因相关蛋白和神经丝200，PGP 9.5提供了高特异性，而不混淆的背景染色。但王一兵等[8]在比较蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)与神经丝蛋白 (Neuro fi lament protein, NFP)对瘢痕组织内神经纤维的染色效果中却发现 PGP 9.5标记人瘢痕神经纤维的效果不如NFP。

Habash等[9]研究也认为PGP 9.5是中枢和周围神经系统最好的免疫组织学标志物，且可清楚地显示在使用兔多克隆抗体常规处理的组织。PGP 9.5标记神经纤维比神经原纤维蛋白更加敏感，尤其是神经纤维的末端区域。PGP 9.5的发现及应用，结合抗PGP 9.5进行免疫组化技术的开展，为研究中枢和周围神经损伤及损伤后神经纤维的再生和重塑提供了极大帮助。

二、PGP 9.5在椎间盘源性腰痛研究中的应用

正常椎间盘组织中央部分是没有神经末梢存在的，仅仅在和毛细血管相邻的纤维环外层区域有很少的免疫组化可以检测到的神经纤维，但在椎间盘退变过程中有向内生长的感知疼痛的神经纤维和血管进入椎间盘的近端的区域，这可能是导致疼痛的原因[10],即神经内生长可能是椎间盘源性腰痛潜在的病理神经解剖基础。

1.退变椎间盘中神经纤维的重塑

Migagi等[11]在椎间盘退变致腰痛的小鼠模型中，利用免疫组化定位神经纤维标记物PGP 9.5和降钙素基因相关肽 (Calcitonin gene related peptide,CGRP) 来确认椎间盘退变的神经分布，发现在退变的椎间盘周围感觉神经分布增加。同时用行为实验证实在椎间盘退变的小鼠模型中，小鼠表现对冷觉、轴向不适，及月龄依赖性的运动障碍增加，推断退变椎间盘周围感觉神经分布增加与上述小鼠行为改变有关。任东风等[12]对26例椎间盘源性腰痛病人，疼痛源性椎间盘MRIT2像均可见高信号区(High signal area, HIZ区) 行手术治疗，将切除的椎间盘组织行PGP 9.5染色观察，并与4例脊柱侧凸病人矫形手术时取出的椎间盘组织对比，结果发现:椎间盘源性腰痛病人HIZ区对应的部位在免疫染色均可观察到PGP 9.5免疫阳性细胞，对照组没有观察到阳性细胞。何江涛等[13]在观察TNF-a (肿瘤坏死因子α)，PGP 9.5在椎体后缘离断症软骨终板中的表达与分布的研究中，对照组为因腰椎骨折行腰椎融合术的年轻病人的软骨终板，对其进行PGP 9.5免疫染色后，均未检测到PGP 9.5阳性染色，说明在正常状态下，软骨终板组织内无PGP 9.5阳性反应神经轴突长入。正常椎间盘仅仅纤维环的外层分布感觉神经纤维，而慢性腰痛病人退变的椎间盘纤维环内层有神经纤维的出现。退变椎间盘中神经纤维的重塑、内生长可能是椎间盘源性腰痛的致病机制。

2.椎间盘神经内生长的机制

神经纤维是如何长入纤维环内层无神经分布区还未得到一致的答案，有“经终板长入”和“经破裂纤维环长入”两种学说[14]。

（1）神经纤维经终板长入

正常椎体的神经分布：一部分是伴随椎体边缘的血管进入椎体，另一部分是窦椎神经的分支经由椎间孔进入椎体（终板内并无神经纤维分布，提示终板也是椎间盘源性疼痛的一个重要来源[15]）。Bailey等[16]用PGP 9.5染色神经纤维来定量分析人类腰4椎体神经分布的空间模型，发现大多数神经都是临近血管壁走形，椎体内神经分布的空间模型与其血管分布的空间模型类似。终板与椎体融合生长，但正常情况下椎体周围血管神经并未向终板内生长。在腰痛病人，Weisskopf等[17]研究发现神经纤维与伴随的微血管通过椎间盘终板组织长入了椎间盘内正常情况下的无神经血管区，且在椎间盘造影术中疼痛的严重程度与相应运动节段变性终板内的血管化程度有一定的相关性。Ohtori等[18]在炎性因子和椎体终板神经长入与椎间盘源性腰痛相关性研究中发现TNF-α在异常终板的表达升高，并诱导PGP 9.5阳性神经轴突向终板长入而最终引起腰痛。Ghilardi等[19]也发现炎性刺激的存在（即通过从退化的椎间盘释放炎症介质）刺激毛细血管和神经纤维生长到炎症区域。

（2）神经纤维经破裂纤维环长入

Fagan等[20]在人造绵羊椎间盘纤维环撕裂的模型中，应用PGP 9.5、酪氨酸羟化酶及降钙素基因受体蛋白对撕裂的纤维环进行免疫染色，分别在1、2、3、12月不同时期上述模型中纤维环撕裂的外围观察到神经分布，且向内生长的神经纤维染色略深于正常纤维环，同样在纤维环内层及髓核中未观察到神经纤维的分布，说明经破裂纤维环神经长入不明显，但并不能否认破裂纤维在椎间盘源性腰痛中的影响。Aoki等[21]在研究椎间盘退变的兔纤维环穿刺模型时，发现在纤维环穿刺部位的针道中并未有神经纤维的长入，而在穿刺点表面形成的瘢痕组织中观察到PGP 9.5免疫反应的神经纤维，推断纤维环破坏形成的瘢痕组织为神经纤维长入提供了物质基础。任东风等[22]采用针刺损伤山羊腰椎间盘后部内层纤维环，建立山羊腰椎间盘退变的模型，观察椎间盘的组织学变化和PGP 9.5阳性神经纤维分布，发现损伤椎间盘3、6个月时内层纤维环存在PGP 9.5阳性神经，且神经是沿着穿刺道及周围生长，而未损伤椎间盘中未检测到PGP 9.5免疫阳性细胞，说明椎间盘损伤后可能诱导了神经内生长。该实验只观察到损伤纤维环内有神经长入，所有髓核组织未检测到PGP 9.5免疫阳性细胞, 但不能排除神经纤维是否会长入髓核组织, 需进一步观察。Freemont等[23]通过椎间盘造影术研究证实疼痛椎间盘内有神经末梢的长入。Melrose等[24]在羊椎间盘纤维环损伤的模型中观察到在椎间盘纤维环损伤后有神经血管向内生长的现象，且与其组织内蛋白多糖降解有相关性。Johnson等[25]研究也发现椎间盘纤维环内侧及髓核组织内的蛋白多糖可以抑制神经轴突的长入，而当纤维环破坏，蛋白多糖降解，对神经的抑制作用降低，导致神经向内生长，因此推断在损伤的纤维环中蛋白多糖降解增多解除对神经生长的抑制，从而诱导了血管和神经的长入。Liang等[26]提出了一个新的假设，即低pH是腰痛的发生和发展的一个可能的原因。低pH促进产生炎症介质同时加速了蛋白多糖在受损椎间盘的耗尽。Shirai等[27]发现神经向内生长并不是单纯的神经纤维再分布，而是伴随血管重塑的组织修复。即PGP 9.5增多代表神经修复性过程。Zevallos等[28]的研究发现在女性子宫内膜异位症病人中检测到分泌蛋白基因产物9.5的基因上调。并在增殖期引起疼痛。但在椎间盘退变中，还没有相关的基因研究。

三、结论与展望

PGP 9.5作为一种神经轴突标记物，对神经纤维特异性强。与传统染色方法相比，其特异性高，染色清晰，操作简单。在椎间盘源性腰痛的研究中，为神经纤维分布、精确定位提供依据。在诊断方面，传统的椎间盘源性腰痛诊断主要依靠椎间盘造影并诱发疼痛。PGP 9.5的应用为腰痛、椎间盘源性腰痛诊断及鉴别诊断提供新的思路。在治疗方面，有学者尝试在间盘内通过热能破坏髓核结构,清除纤维环内神经末梢，但激光温度难以调控,且常损伤周围组织导致炎症，技术要求高[29]。目前学者将能灭活神经末梢的亚甲蓝用于椎间盘源性腰痛的治疗[30,31]，在动物试验中也观察到，亚甲蓝毁损了长入椎间盘内的神经纤维，从而缓解椎间盘源性腰痛的症状[32]，但目前临床应用较少。PGP 9.5的应用为精准靶向治疗提供依据及治途径，也是检测治疗效果的指标。PGP 9.5只能证实在退变椎间盘中确有神经纤维长入原本无神经分布的区域，并可能引起疼痛，但神经向内生长的潜在机制目前尚不完全清楚，将是今后一个研究重点。

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