PKC抑制剂对甲醛诱导的内脏炎性痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化的影响*

张家君 岳 伟 张灿文 牛敬忠 胡冬梅 袁 慧 杨明峰 张颜波△

（泰山医学院附属医院1超声科；2消化科；3神经内科，泰安271000）

炎症肠道疾病和癌症相关性内脏痛是临床上常见的内脏痛，内脏炎症痛机制和治疗是目前国内外研究的热点、难点。内脏痛发病机制尚不明确，其研究远远落后于躯体痛，严重影响了内脏痛病人的治疗与预后。众多信号分子、受体在内脏痛觉特别是痛觉敏感化形成和维持中起重要作用，是目前研究的主要方向[1～5]。我们既往的研究发现，大鼠脊髓内PKC及其PKCγ、PKCε亚型参与甲醛内脏炎症痛发生、发展过程；Galan等和Sakurai等研究发现，脊髓和脊神经节内ERK参与内脏炎症痛痛觉敏感化的维持PKC、ERK1/2已经作为内脏炎症痛新型药物治疗靶点[6～8]。ERK1/2是否作为PKC的下游信号通路在内脏炎症痛发病机制中起重要作用，对内脏炎症痛靶向治疗具有重要意义。所以本实验利用甲醛直肠黏膜下注射内脏炎症痛大鼠模型[6,9～11]，通过蛛网膜下腔注射给予PKC抑制剂H-7，观察H-7对内脏炎症痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平的影响，探讨PKC- ERK1/2信号通路在内脏炎症痛发病机制中的作用。

方 法

1.试剂与材料

H-7（Sigma公司，美国），甲醛、戊巴比妥钠（北京西中化工厂），PE-10管（ID:0.28 mm; OD:0.61 mm,Becton Dickinson公司，美国），有机玻璃行为学观察箱（首都医科大学神经生物研究室制），大鼠手持直肠窥器（专利号：CN200820173538.2），兔ERK 1/2一抗、兔p-ERK 1/2一抗、actin一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（美国Santa Cruz公司，美国），ECL反应底物（Bio-Rad公司，美国），BCA蛋白分析试剂盒（PIERCE公司，美国），Gel Doc凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司，美国）。

2.实验动物及分组

选用清洁级雄性SD大鼠（重200～250 g，山东省中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（鲁）2005-0015），实验随机分为5组：正常对照组（N组）；甲醛(formalin, F)直肠致炎组（F组）；甲醛直肠致炎和脊髓蛛网膜下腔内插管(intrathecal, IT)组（IT组）；甲醛直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射生理盐水组（NaCl组）；甲醛直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射H-7组（ H-7组）；每组大鼠24只，共120只。

3.脊髓蛛网膜下腔内插管及给药

根据我们实验室既往成熟方法[6,9～11]，用PE-10管插入大鼠脊髓蛛网膜下腔，插入长度7.5 cm，外端留有4.5 cm左右。本实验中NaCl和H-7组，分别在甲醛直肠致炎前30 min经PE-10插管注射20 μl 0.9% NaCl、20 μl H-7 溶液（含 5 μg H-7），然后注入10 μl 0.9% NaCl冲洗插管，保证注射药品全部进入蛛网膜下腔。

4.内脏炎症痛模型复制

根据我们实验室既往成熟方法[6,9～11]，大鼠乙醚持续麻醉，经肛门插入自制的直肠窥器（专利号：CN200820173538.2），距肛门约35 mm处，用针长8 cm的1 ml注射器于直肠黏膜下注射100 μl 5%的甲醛。

5.内脏痛行为学观察

甲醛致痛后，大鼠共有4种疼痛行为：①舔腹（L）；②伸腰（B）；③侧扭（C）；④全身收缩（W）。疼痛评分公式计算：S = 1L + 2B + 3C + 4W。L，B，C和W代表在一段时间内相应行为的次数。4组大鼠，每组8只，每15 min进行一次疼痛计分，连续记录大鼠的行为120 min[6,9～11]。行为学实验的大鼠在120 min观察后进行ERK1/2磷酸化水平检测。

6. ERK1/2磷酸化水平检测

在甲醛造模后30 min、60 min和120 min取出L6-S1节段脊髓，根据我们既往的方法进行ERK1/2磷酸化检测[9]。磷酸化ERK1/2 的蛋白检测后，同一张NC膜，再与总ERK1/2抗体进行第二次Western blot 杂交反应，获得ERK1/2总蛋白印迹结果。Gel Doc凝胶成像分析系统同时进行actin水平检测，ERK1/2相对磷酸化水平以p-ERK1/2与ERK1/2的比值表示。

7.统计学方法

结 果

1. PKC抑制剂H-7减轻内脏炎症痛疼痛反应

4个实验组大鼠在注射甲醛后30 min均达到疼痛评分的最大值，从注射甲醛后45 min至120 min内，疼痛评分逐渐降低。前60 min内行为表现主要以W、C、B反应为主；而在后60 min内主要以L反应为主。F、IT、NaCl组和H-7组大鼠在注射甲醛后30 min均达到疼痛评分的最大值，从注射甲醛后45 min至120 min内，疼痛评分逐渐降低，120 min时疼痛评分正常。H-7组在前90 min内疼痛分数显著低于 F组 (P＜ 0.05或P＜ 0.01)，F分别与IT、NaCl组相比未见显著性差异(P＞ 0.05，见表1)。

2.内脏炎症痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平增加

与N组相比，F组甲醛直肠黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平增加，30 min时达最高水平，60 min时仍高于对照组，有显著性差异(P＜ 0.05或P＜ 0.01)；60 min后磷酸化水平逐渐下降，120 min时磷酸化水平与N组相比，无显著性差异(P＞ 0.05)。IT组、NaCl组与F组相比，无显著性差异(P＞ 0.05，见图1～4)。

3. PKC抑制剂H-7降低内脏炎症痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平

与N相比，H-7组甲醛直肠黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平也增加，30 min时达最高水平，60 min时仍高于对照组，有显著性差异(P＜ 0.05或P＜ 0.01)；60 min后逐渐下降，120 min时下降至正常水平(P＞ 0.05)。在甲醛注射后60 min内，H-7组与F组相比，ERK1/2磷酸化水平明显下降，有显著性差异 (P＜ 0.05或P＜ 0.01)，120 min时无显著性差异(P＞ 0.05，见图1～4)。

讨 论

在临床中由炎症而导致的内脏炎症痛非常常见，而且炎症也是导致内脏器官痛敏的最常见原因，常伴随一系列的征候群，如肠易激综合症(irritable bowel syndrome, IBS)等。内脏痛与躯体痛发病机制不同，所以内脏痛与躯体痛对镇痛药物的疗效也不相同。与躯体痛相比，在炎性肠道疾病疼痛的治疗中，应用阿片类药物会导致较高的副作用和死亡率；同样应用非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)镇痛效果也不理想[4]。所以研发新型、有效的内脏炎症痛镇痛药物迫在眉睫。信号通路将是内脏炎症痛新型镇痛药物的研发方向，针对多个信号通路联合药物镇痛治疗优于单一药物，联合治疗是内脏痛治疗原则[4,12]。根据既往我们研究基础和目前国内外进展，所以本研究选择PKC、ERK1/2两条信号通路进行研究，并且将PKC、ERK1/2作为一条上下游信号通路进行研究，是本研究的一个创新点。

表1 注射甲醛后各组不同时间段的疼痛分数(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

表1 注射甲醛后各组不同时间段的疼痛分数(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

F: formalin group; IT: intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with F group.

Group Pain Score 15 30 45 60 75 90 105 120 F 60.32±6.47 88.47±7.89 47.56±4.56 25.98±3.04 14.78±2.32 10.35±1.79 3.41±1.65 3.22±0.97 IT 64.78±7.06 89.45±7.65 48.78±5.01 22.47±3.65 13.41±2.74 11.01±2.01 3.73±1.78 3.34±0.87 NaCl 62.62±6.14 86.25±8.03 49.45±4.54 24.45±3.17 14.14±2.98 9.88±2.74 4.87±1.58 3.25±0.96 H-7 44.52±5.18** 65.78±6.65** 35.74±4.65** 16.42±3.89* 8.57±2.69* 5.36±1.87* 3.58±1.54 3.52±1.12

图1 注射甲醛后30 min ERK1/2磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation of ERK1/2 at 30 minutes after formalin injection

图2 注射甲醛后60 min ERK1/2磷酸化水平Fig.2 Phosphorylation of ERK1/2 at 60 minutes after formalin injection

图3 ERK1磷酸化水平变化Fig.3 Changes of phosphorylation level of ERK1 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

图4 ERK2磷酸化水平变化Fig.4 Changes of phosphorylation level of ERK2 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

在本实验中，甲醛注射后30 min达到疼痛的高峰，注射90 min后，甲醛组和对照组相比，没有明显差异，我们的实验结果和Miampamba等人的结果一致[13]，说明甲醛直肠黏膜下注射诱导内脏炎症痛模型，是国际上公认的、可靠的内脏痛模型，是内脏炎症痛的研究手段。PKC抑制剂H-7在甲醛注射后90 min内，能明显抑制内脏炎症痛行为反应，说明PKC抑制剂可作为内脏炎症痛的治疗药物。在甲醛注射30 min时ERK1/2磷酸化水平达最高水平，60 min仍高于对照组，说明ERK1/2参与内脏炎症痛的形成和维持过程；PKC抑制剂H-7在甲醛注射后60 min内能明显抑制ERK1/2磷酸化水平，说明ERK1/2可能作为PKC的下游信号通路参与了内脏炎症痛的发病机制。PKC-ERK1/2作为一条信号通路参与信号传导，这与目前国际上应用不同实验模型得出的结果一致[14～18]。El-Zein等研究发现，瘦素通过PKC/ERK信号通路抑制肠道葡萄糖的吸收[17]；Sun[16]等也研究证实，Egr-1通过PKC/ERK信号通路介导慢性缺氧引起的肾间质纤维变性。

综上所述，PKC抑制剂H-7能降低内脏炎症痛疼痛评分和抑制脊髓ERK1/2磷酸化水平，ERK1/2是PKC的下游信号通路在内脏炎症痛发病机制中起重要作用，对内脏炎症痛靶向治疗具有重要意义。

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