SAHA-CTSB对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的诱导作用

孙玮璐，韩翰

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2015级12班，辽宁 沈阳 110034；2.基础医学院生物化学与分子生物学教研室）

SAHA-CTSB对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的诱导作用

孙玮璐1，韩翰2*

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2015级12班，辽宁 沈阳 110034；2.基础医学院生物化学与分子生物学教研室）

目的：探讨辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）是否经由组织蛋白酶B（CTSB）的有效调控诱导人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞凋亡的发生。方法：采用Western blot及ELISA法检测SAHA、CTSB抑制剂（Cystain C）对乳腺癌细胞中CTSB表达的影响；采用Muse自动分析仪检测SAHA、Cystain C对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力及凋亡的影响。结果：Cystatin C对乳腺癌细胞中CTSB的有效抑制浓度为100 ng/ml；Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌细胞后，乳腺癌细胞活力及凋亡细胞比率较单独SAHA处理组相比恢复明显，差异均有统计学意义。结论：SAHA对乳腺癌的生长抑制作用需要CTSB的参与。

活乳腺癌；SAHA；CTSB；凋亡

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤［1-2］。据统计，在过去的20年中，全球乳腺癌绝对数量上升了1.4倍，我国每年新发女性乳腺癌病例约27.9万，位居女性发病首位，且三阴乳腺癌发病比例越来越大［3-4］。目前，乳腺癌的治疗仍以手术为主，辅助放疗和化疗，虽然有一定的疗效，但仍存在严重的不良反应和普遍的耐药现象［5-6］。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）作为抗肿瘤药物为探索女性恶性肿瘤治疗提供了新方向［7-9］。辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是目前已知最经典的HDACi之一，研究表明，SAHA对乳腺癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌等均有高效杀伤作用，并且不良反应较少［10-12］。

组织蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）是溶酶体内半胱氨酸组织蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族，其广泛地参与蛋白质的降解，并在各种生理和病理过程中发挥重要作用［13-14］，随着研究的深入，发现其与细胞凋亡有着密切的联系［15-16］。

研究表明，SAHA可通过影响乳腺癌细胞周期来抑制细胞增殖［17-19］，但其全部作用靶点并没有阐明，因此，有针对性地筛选出SAHA作用的新效应靶点是十分必要的。本文选取三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231，探讨SAHA是否经由CTSB的有效调控，启动细胞凋亡反应，从而抑制乳腺癌细胞的生长增殖。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自美国ATCC细胞库；Leibovitz′s L-15培养基、胎牛血清、青霉素以及链霉素购自美国Thermo公司；SAHA、CTSB抑制剂（Cystain C）购自美国Sigma-Aldrich 公司；Muse Annexin V&Dead Cell、Muse Count&Viability试剂盒购自德国Merck Millipore公司；Human Pro-Cathepsin B ELISA试剂盒购自美国R&D公司；其他的化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231培养于含15%胎牛血清的Leibovitz′s L-15培养基（含100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的链霉素），37℃、5%CO2的条件下传代培养。

1.2.2 Western blot法检测SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞中CTSB的影响 将5×105个/ml的MDAMB-231细胞接种于6孔板各孔内，待细胞铺满率＞75%进行L-15无血清同步化处理后，加入5 μmol/L的SAHA与不同浓度的CTSB抑制剂Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培养48 h，收集细胞后，采用RIPA蛋白裂解液提取出的蛋白应用BCA蛋白分析试剂盒测定，调整蛋白浓度。蛋白煮沸变性后，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转移至PVDF膜上。封闭液封闭1 h，一抗4℃过夜。TBST冲洗10 min，3次，将膜放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗中，室温中摇床振荡60 min，用TBST洗膜10 min，3次，将等体积混合的ECL化学发光底物A、B液均匀加在PVDF膜上，显色5 min。化学发光成像系统曝光后，计算膜上各抗体标记点的灰度值。

1.2.3 ELISA检测SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞中CTSB表达量的影响 将5×105个/ml的MDAMB-231细胞接种于6孔板各孔内，待细胞铺满率＞75%进行L-15无血清同步化处理后，加入5 μmol/L的SAHA与不同浓度的CTSB抑制剂Cystain C（0、20、40、60、80、100 ng/ml）共同培养48 h，加入裂解液进行裂解后，经酶标抗体孵育、底物显色处理，在450 nm处用酶标仪测定SAHA和Cystain C各处理组对MDA-MB-231细胞中CTSB蛋白表达的影响。

1.2.4 细胞活力检测 将5×105个/ml乳腺癌MDAMB-231细胞分别接种于6孔板各孔中，待细胞铺满率＞75%进行无血清同步化处理。MDA-MB-231细胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105个乳腺癌MDA-MB-231细胞和450 μl Count&Viability试剂共同孵育5 min。通过Muse自动细胞分析仪（德国MerckMillipore公司）Cell Count&Viability software module分析各处理因素诱导MDA-MB-231细胞活力发生的情况。1.2.5 细胞凋亡检测 将5×105个/ml乳腺癌MDAMB-231细胞分别接种于6孔板各孔中，待细胞铺满率＞75%进行无血清同步化处理。MDA-MB-231细胞加入5 μmol/L SAHA和100 ng/ml Cystain C共同孵育。取2×105个乳腺癌MDA-MB-231细胞和100 μl Muse Annexin V＆Dead Cell试剂室温孵育20 min。应用自动细胞分析仪Muse Cell Analyzer检测各处理因素诱导MDA-MB-231细胞凋亡发生的情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，结果以均值±标准差表示，多组数据比较采用单因素方差分析，2组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞中CTSB的影响 Western blot检测结果显示：与空白对照组相比，SAHA能够显著增加乳腺癌细胞中CTSB的蛋白含量，当加入CTSB特异性抑制剂Cystain C后，发现Cystain C对SAHA引起的CTSB表达升高具有不同抑制作用，仅Cystain C浓度达到100 ng/ml抑制作用达到最强，与SAHA+0 ng/ml Cystatin C组比较，差异有统计学意义，见图1。

图1 Western blot检测SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞MDA-MB-231中CTSB表达的影响

ELISA结果也验证了上述实验结果，与空白对照组相比，SAHA可显著升高乳腺癌MDA-MB-231细胞中CTSB的相对表达量。低浓度的Cystatin C不能有效地抑制SAHA引起的CTSB相对表达量的升高，只有浓度达到100 ng/ml时，CTSB的相对表达量才有所下降，且与SAHA+0 ng/ml Cystatin C组比较，差异有统计学意义，见图2。

图2 ELISA检测SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞MDAMB-231中CTSB表达的影响

2.2 SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞活力的影响 为明确CTSB在SAHA抑制乳腺癌细胞生长过程中的作用，将100 ng/ml Cystain C作用于MDAMB-231细胞中以抑制CTSB的表达，分析SAHA对乳腺癌细胞活力的影响。结果发现，单独SAHA能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖，活细胞比率下降（P＜0.05）；单独Cystain C对乳腺癌细胞影响不大，细胞活力无明显的变化；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌细胞后，乳腺癌细胞活力较单独SAHA处理组相比恢复明显，MDA-MB-231活细胞比率高于单独SAHA处理组（P＜0.05），见图3。

图3 Muse自动细胞分析仪分析SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞活力的影响（*P＜0.05）

2.3 SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞凋亡的影响 细胞凋亡结果显示：单独SAHA能够显著诱导乳腺癌细胞的凋亡，凋亡细胞（含早、晚期凋亡）和死细胞比率升高（P＜0.05）；单独Cystain C作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞后凋亡细胞（含早、晚期凋亡）和死细胞比率与空白对照组相比相差不大；而Cystain C和SAHA共同作用乳腺癌细胞后，乳腺癌MDA-MB-231凋亡细胞（含早、晚期凋亡）和死细胞比率较SAHA组下降（P＜0.05），见图4。

图4 Muse自动细胞细胞仪分析SAHA、Cystain C对乳腺癌细胞凋亡的影响（*P＜0.05）

3 讨论

细胞凋亡是一个高度程序化的主动过程，由一系列相关基因进行调控［20］。在机体发育过程中，细胞凋亡在组织和器官的构建中起着重要的作用，是通过启动细胞自身的内部死亡机制而产生的一种细胞死亡方式，诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗肿瘤药物的作用机制之一［21］。

前期研究确定了5 μmol/L SAHA作用三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h后可明显抑制乳腺癌细胞的生长［11］，本研究进一步发现，5 μmol/L的SAHA可导致乳腺癌细胞活力下降，诱导乳腺癌细胞凋亡。Western blot和ELISA等实验结果显示，SAHA作用乳腺癌细胞过程中伴随着CTSB蛋白表达量的增高。CTSB可以调节细胞凋亡，调节其他蛋白酶的表达，与细胞凋亡存在密切关系［15-16］。SAHA是否通过调控细胞中CTSB的表达从而诱导细胞凋亡的产生目前还无法确定。我们利用CTSB特异性抑制剂Cystain C阻断乳腺癌MDAMB-231细胞中CTSB的表达，检测CTSB在SAHA抑制乳腺癌细胞生长中的调控作用。

本研究Western blot实验结果显示，当Cystatin C浓度达到100 ng/ml时，能够显著抑制SAHA引起的乳腺癌细胞中CTSB的升高，ELISA证实了上述实验结果。接下来，我们将筛选出的Cystain C、SAHA作用于MDA-MB-231细胞中，分别分析了乳腺癌细胞活力和细胞凋亡的变化情况。发现当利用Cystain C抑制乳腺癌细胞中CTSB的表达时，对乳腺癌细胞影响不大，细胞活力及凋亡无明显的变化，说明CTSB功能失活对乳腺癌细胞的生长增殖没有明显调控作用，同时也表明Cystain C不会产生细胞毒性，可以作为本实验中独立因素抑制MDA-MB-231细胞中CTSB的表达；而单独SAHA处理显著抑制了乳腺癌细胞的生长，表现为细胞活力下降，细胞凋亡细胞（含早、晚期凋亡）和死细胞比率明显上升；用Cystain C抑制CTSB的表达后，SAHA处理的乳腺癌MDA-MB-231细胞的活细胞比率较SAHA单独处理组升高，而凋亡细胞（含早、晚期凋亡）和死细胞比率较SAHA单独处理组降低。实验结果表明抑制细胞中CTSB的表达能够明显阻抑SAHA对乳腺癌细胞的生长抑制效应，因此，SAHA对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用需要CTSB的调控。

综上所述，SAHA的抗肿瘤作用虽已被证实，但其全部作用靶点并未完全阐明。而本研究初步阐明了SAHA经CTSB介导产生细胞凋亡，从而抑制了乳腺癌细胞的生长增殖。

［1］ Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

［2］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［3］陈万青，郑荣寿，张思维，等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析［J］.中国肿瘤，2016，25（1）：1-8.

［4］ Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（7）：3983-3988.

［5］ Poncet B，Bachelot T，Colin C，et al.Use of the monoclonal antibody anti-HER2 trastuzumab in the treatment of metastatic breast cancer： a cost-effectiveness analysis［J］.Am J Clin Oncol，2008，31（4）： 363-368.

［6］ Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature， 2001，410（6824）：50-56.

［7］ Marks PA，Xu WS.Histone deacetylase inhibitors：Potential in cancer therapy［J］.J3 Cell Biochem，2009，107（4）：600-608.

［8］ Bolden JE，Peart MJ，Johnstone RW.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（9）：769-784.

［9］ Kleer CG，Cao Q，Varambally S，et al.EZH2 is a marker of a ggressive breast cancer and promotes neoplastic transformation of breast epithelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（20）：11606-11611.

［10］ Li GC，Zhang X，Pan TJ，et al.Histone deacetylase inhibitor trichostatin A inhibits the growth of bladder cancer cells through induction of p21WAF1 and G1 cell cycle arrest［J］.Int J Urol，2006，13（5）： 581-586.

［11］ Feng X，Han H，Zou D，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid-induced specific epigenetic regulation controls Leptininduced proliferation of breast cancer cell lines［J］.Oncotarget，2017，8（2）：3364-3379.

［12］ Kelly WK， Richon VM，O′Connor O，et al.Phase I clinical trial of histone deacetylase inhibitor： suberoylanilide hydroxamic acid administered intravenously［J］.Clin Cancer Res， 2003， 9（10 Pt 1）： 3578-3588.

［13］ Guicciardi ME，Leist M，Gores GJ.Lysosomes in cell death［J］.Oncogene，2004，23（16）： 2881-2890.

［14］ Hook GR， Yu J， Sipes N， et al.The cysteine protease cathepsin B is a key drug target and cysteine protease inhibitors are potential therapeutics for traumatic brain injury ［J］.J Neurotrauma，2014，31（5）：515-529.

［15］ Yang C， Wu C， Xu D， et al.AstragalosideII inhibits autophagic flux and enhance chemosensitivity of cisplatin in human cancer cells［J］.Biomed Pharmacother， 2016， 81：166-175.

［16］ Wootz H，Weber E，Korhonen L，et al.Altered distribution and levels of cathepsinD and cystatins in amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice：possible roles in motor neuron survival［J］.Neuroscience，2006，143（2）：419-430.

［17］聂建云，刘馨，金从国，等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞株MCF-7增殖周期的影响［J］.中国综合临床，2009，25（12）：1238-1240.

［18］聂建云，陈杨萍，黄云超.辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）对乳腺癌细胞增殖影响的动物实验研究［J］.实用癌症杂志，2011，26（3）：221-225.

［19］周伟强.SAHA抑制瘦素诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的分子机制［J］.沈阳医学院学报，2017，19（2）：84-86，90.

［20］ Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281（5381）：1309-1312.

［21］ Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis［J］.Nature，2000，407（6805）：770-776.

SAHA Induces Apoptosis in Triple-negative Breast Cancer Cell MDA-MB-231 via the Regulation of CathepsinB

SUN Weilu1，HAN Han2*
（1.Class 12 Grade 2015，Shenyang Medical College Shenyang 110034，China；2.Department of Biochemistry）

Objective：To clarify the regulation role of cathepsin B （CTSB） in cell apoptosis induced by SAHA in triplenegative breast cancer cell MDA-MB-231.Methods：MDA-MB-231 cells were incubated with SAHA and/or Cystain C，the expression of CTSB was determined by Western blot and ELISA，the cell viability and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by Muse cell analyzer.Results：The optimal concentration of Cystain C was 100 ng/ml.The cell viability and apoptosis test demonstrated that the combination treatment of Cystatin C and SAHA significantly resumed the inhibitory effect caused by SAHA alone.Conclusion：CTSB plays an important role in apoptosis induced by SAHA in triple-negative breast cancer cell MDA-MB-231.

breast cancer；SAHA；CTSB；apoptosis

R725

A

1008-2344（2017）06-0530-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.021

沈阳医学院科研基金项目（No.20141004）；沈阳医学院大学生科研课题（No.20179002）

韩翰（1982—），女（汉），讲师，研究方向：肿瘤分子机制研究.E-mail：hanhan82831@163.com

2017-07-07

（文敏编辑）