鞘氨醇激酶1在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义

方长英，朱传卫，余良河，何勇勇*

鞘氨醇激酶1在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义

方长英1，朱传卫1，余良河2，何勇勇1*

（1.安徽省宣城中心医院检验科，安徽 宣城 242000；2.第二军医大学东方肝胆外科医院肝外六科）

目的：探讨原发性肝癌组织中鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）的表达及其临床意义。方法：采用Real-time PCR和免疫组化检测252例原发性肝癌患者癌组织和癌旁组织中SPHK1的表达水平，分析其对肝癌患者生存和复发的影响。结果：SPHK1蛋白在肝癌组织中阳性表达率为71.8%，而在癌旁组织中为11.1%（P＜0.01），高表达SPHK1蛋白的肝癌患者生存期较短（P=0.000）而复发率较高（P=0.025）。结论：SPHK1是肝癌的一个潜在分子靶点，有助于判断患者的复发和预后。

鞘氨醇激酶1；原发性肝癌；免疫组化；复发

原发性肝癌是世界上常见的消化系统恶性肿瘤，每年约60万患者死于肝癌，其死亡率居于肿瘤第三位，严重威胁人类健康［1-2］。随着科技的发展，肿瘤诊疗水平有所提高，然而只有三分之一的肝癌患者能够进行肿瘤切除［3］，并且术后效果并不理想，患者5年生存率只有17%～53%，复发率则高达70%［4-5］。因此，应从原发性肝癌的分子机制上进行研究，了解其发生和发展的过程，寻找一个潜在的分子治疗靶点，提高肝癌患者生存率，降低复发率。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）是细胞中一种蛋白酶，催化鞘氨醇转变为磷酸鞘氨醇，产生的磷酸鞘氨醇与G蛋白耦联受体中的磷酸鞘氨醇受体结合后［6］，会产生一系列生物学效应，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移和侵袭等［7-9］。众多研究表明SPHK1能够促进肿瘤生长、血管生成、肿瘤转移和复发等［10-12］，高表达SPHK1的恶性肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、白血病、宫颈癌和鼻咽癌等患者有着较低生存率和较高复发率［13-18］。本文通过研究SPHK1在肝癌和对应癌旁组织中表达情况，分析其表达水平与肝癌患者生存期和复发率关系，为临床治疗原发性肝癌提供一个潜在分子靶点。

1 资料与方法

1.1 病例资料 随机收集2008年1月至2011年12月第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外六科3个治疗组行肝癌手术的450例原发性肝癌组织和对应的癌旁组织标本。术中所有肿瘤全部被切除，手术边界距离肿瘤大于3 cm，术后病理证实为原发性肝癌且边缘组织没有肿瘤细胞，标本置于液氮中保存。其中，252例原发性肝癌患者标本符合本研究纳入标准：（1）术前检查显示患者WHO评分为0～1分；（2）肝功能分级为Child A级；（3）患者术前未进行化疗、射频消融和分子靶向治疗等。（4）患者基本资料和病例资料完整，且全部进行了随访。

1.2 Real-time PCR检测肝癌组织和癌旁组织中SPHK1的表达水平 根据GenBank提供的基因序列，应用Primer Express 3.0设计SPHK1引物，各引物序列、扩增片段长度见表1，由上海吉玛科技公司合成。将肝癌组织和癌旁组织用新鲜的PBS清洗，剪碎后加入适量Trizol，按照说明书提取肝癌组织和癌旁组织RNA，使用分光光度计测量肝癌组织和癌旁组织RNA的浓度和纯度。采用美国Gibco公司RevertAid First strand Cdnasynthsis试剂盒对样本RNA进行反转录，反转录体系为20μl，反应条件为42℃条件下30 min，95℃条件下2 min，-20℃保存。Real-time PCR在ABI公司7300Real-time PCR仪完成，反应体系为20μl，条件为：95℃ 变性30 s，随后95℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72℃ 10 s，循环40次。实验结果重复3次。

表1 Real-time PCR引物基本信息

1.3 免疫组化检测252例原发性肝癌患者癌组织和癌旁组织中SPHK1蛋白的表达水平 使用英国Abcam公司生产的EnVisionTM+kit免疫组化试剂盒，按照说明书对组织进行包埋切片，置于60℃烤箱10 h，随后用二甲苯浸泡脱蜡和乙醇水合，再放入柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复，BSA封闭后弃去，加一抗过夜，PBS清洗后加羊抗兔二抗，DAB显色后显微镜下观察染色程度，双蒸水终止染色，苏木紫复染，脱水、透明和封片后镜检。SPHK1蛋白阳性反应标准为：细胞染色程度和阳性染色细胞率，染色程度分为1、2、3和4四个等级（1和2为没有染色或染色极少代表阴性，3和4为染色较强代表阳性）；阳性染色细胞率为染色阳性细胞数目与总细胞数目的比值，分为0～19%、20%～39%、40%～60%、＞60%。最后，阳性率＜40%为SPHK1低表达，≥40%为SPHK1高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理。SPHK1表达水平与临床病理参数之间的关系采用χ2检验和Fisher确切概率法，计量资料比较采用t检验，术后患者的生存和复发曲线采用Kaplan-Meier方法，生存和复发资料使用Cox模型进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原发性肝癌组织和癌旁组织中SPHK1表达水平差异 Real-time PCR结果显示肝癌组织中SPHK1基因表达水平明显高于癌旁组织，其表达量约为癌旁组织4倍（P＜0.01）；免疫组化的结果也显示肝癌组织SPHK1蛋白表达水平高于癌旁组织，分别为71.8%和11.1%，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 SPHK1基因及SPHK1蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 SPHK1蛋白表达与肝癌病理参数和预后的相关性 SPHK1在肝癌组织中表达与包膜有无（P=0.045）、肝硬化（P=0.002）、肿瘤数目（P=0.003）和肿瘤分期（P=0.019）有关，见表2。Kaplan-Meier分析结果表明SPHK1蛋白表达较高患者有较低生存率（P=0.000），见图2A，高表达患者1年生存率为24.7%，3年生存率为6.3%；而低表达组1年生存率为59.3%，3年生存率为27.6%。并且高表达SPHK1蛋白患者复发率高于低表达的原发性肝癌患者（P=0.025），见图2B，高表达组1年复发率为93.9%，3年复发率为98.4%；低表达组1年复发率为78.9%，3年复发率为94.8%。

表2 SPHK1蛋白表达与肝癌病理参数的相关性

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析SPHK1蛋白在252例原发性肝癌组织的表达水平与患者总体生存率及复发率的关系

3 讨论

本研究结果显示原发性肝癌组织中SPHK1基因和蛋白表达量明显高于对应的癌旁组织，且SPHK1蛋白表达水平与肿瘤包膜有无、肝硬化、肿瘤的数目和临床分期密切相关。统计分析结果表明高表达SPHK1蛋白的原发性肝癌患者比低表达患者生存率低，1年生存率下降34.6%，3年生存率下降21.3%；同时高表达患者有着较高的复发率，1年复发率增加15%，3年复发率增加3.6%。本研究结果说明SPHK1的高表达在原发性肝癌的发生和发展过程中起着重要作用。

研究发现SPHK1是一种癌基因，促进肿瘤细胞的形成并抑制其凋亡。正常的NIH3T3成纤维细胞在SPHK1过表达的情况下发生了恶性转化［19］。动物实验证实SPHK1表达水平增高可以促进肿瘤细胞生长和转移，SPHK1抑制剂的使用可以抑制肿瘤生长［20-21］。Li等［22］在临床研究中发现胃癌组织中的SPHK1表达水平高于正常的癌旁组织，其表达水平与胃癌的发生发展密切相关，高表达SPHK1的胃癌患者5年生存率较低且复发率较高。此外，过表达SPHK1的肿瘤患者在化疗的过程中容易产生耐药性，如SPHK1蛋白升高的白血病患者在进行阿霉素和足叶乙甙化疗时产生抵抗［23］；前列腺癌细胞在SPHK1过表达的情况下使用喜树碱化疗时效果减弱［24］。临床研究表明SPHK1抑制剂的使用可以增加结肠癌细胞凋亡，增强5-FU的化疗敏感性［25］。

本研究结果显示肝癌组织中SPHK1基因和蛋白表达显著升高。Lu等［26］近期基础研究结果表明肝癌细胞中SPHK1过表达使肝癌细胞的活性增加，羊藿素可抑制SPHK1蛋白活性，使肝癌细胞的活性下降并出现凋亡；动物实验结果表明使用羊藿素可明显抑制裸鼠体内肝癌肿瘤生长。Li等［27］研究发现使用siRNA或FTY720阻断SPHK1能显著降低鼻咽癌细胞增殖和迁移，增加其生长周期使癌细胞凋亡速度加快；临床研究结果显示高表达SPHK1肿瘤患者预后较差。SPHK1在肝癌中扮演着重要的角色，高表达SPHK1肝癌细胞恶性度增加；高表达SPHK1的肝癌患者生存率低而复发率高。

综上所述，原发性肝癌组织中SPHK1高表达与恶性病理学特征密切相关，SPHK1蛋白是肝癌患者预后的一个有效标志物和潜在分子治疗靶点，为肝癌的分子靶向治疗提供了研究基础。

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Expression of Sphingosine Kinase 1 in Primary Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

FANG Changying1，ZHU Chuanwei1，YU Lianghe2，HE Yongyong1*
（1.Department of Clinical Laboratory，Xuancheng Central Hospital， Xuancheng 242000， China；2.Department Ⅵ of Hepatic Surgery，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，The Second Military Medical University）

Objective：To investigate the expression of sphingosine kinase 1 （SPHK1） in primary hepatocellular carcinoma tissues and its clinical significance.Methods：Real-time PCR and immunohistochemistry methods were used to detect the expression levels of SPHK1 in 252 cases of hepatocellular carcinoma tissues and paired normal tumor-adjacent tissues.The tumor recurrence and survival of the primary hepatocellular carcinoma patients were analyzed.Results：The positive expression rate of SPHK1 was 71.8%in primary hepatocellular carcinoma tissues，while 11.1%in paired adjacent tissues（P＜0.01）.The patients with high expression levels of SPHK1 protein had higher recurrence rate and poorer prognosis（P＜0.01 or 0.05）.Conclusion：SPHK1 may be a potential molecular target and helps to determine the patient's recurrence and prognosis.

sphingosine kinase 1；primary hepatocellular carcinoma；immunohistochemistry；recurrence

R735.7

A

1008-2344（2017）06-0473-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.004

何勇勇（1984—），男（汉），主管检验师.研究方向：肿瘤标志物.E-mail：heyongyong84@sina.com

2016-06-26

（文敏编辑）