色素上皮来源因子促进晶状体上皮细胞增殖机制初探

晶状体上皮细胞(lens endothelial cells,LECs)在晶状体细胞的生长和衰老过程中起重要的调节作用，与白内障的起因和发展过程息息相关。LECs的这种行为通过许多的细胞内外信号转导途径进行分子调节[1，2]。色素上皮来源因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是一种在人体内广泛存在的细胞因子。前人研究表明PEDF和血管内皮细胞生长因子(VEGF)有拮抗作用[3，4]。在人的房水和LECs中PEDF的水平与人体衰老和白内障的发病程度有正相关性[5-7]。但是，PEDF是否对LECs的生长起调节作用，以及相关的分子机制还未有报道。本文着力于阐明PEDF对LECs生长的调节作用以及体内外实验的相关分子机制研究。

资料与方法

一、对象

82例(82只眼)白内障患者的纳入准则：(1)年龄52～92岁；(2)非先天性白内障，非代谢性白内障，非继发性白内障；(3)眼底病变、葡萄膜炎、青光眼；(4)无眼外伤和眼内手术史；(5)晶状体前囊混浊；(6)无其他晶状体混浊，除非与年龄有关的晶状体混浊。

晶状体上皮细胞系HLE-B3培养：完全培养基+10%胎牛血清，80%密度时胰酶消化，传代和冻存。

二、方法

1.RT-PCR检测PEDF mRNA表达：白内障摘除术，获取晶状体上皮细胞，接种在培养瓶中。HE染色后检测细胞培养密度，分为低密度组(<4000/mm2)和高密度组(>4500/mm2)，每组20例。利用RT-PCR试剂盒提取晶状体囊膜组织中RNA并合成cDNA。PEDF和β-actin的引物设计如表1。采用半定量逆转录PCR技术扩增mRNA，分析电泳图及扩增片段，计算PEDF和mRNA相对表达量。

表1 PEDF和β-actin引物

2.Annexin V法检测LECs增殖和凋亡：加PEDF实验组：DMEM完全培养基+10%FBS+50ng/ml PEDF，培养72 h。不加PEDF对照组：DMEM完全培养基+10%FBS。采用annexin V-FITC/7-AAD复染法检测两组的细胞周期和凋亡情况。

重悬收集细胞并计数，0.5×106～1×106，一管细胞悬液中加100 μl缓冲液和100 μl Annexin V-FITC避光孵育，另一管细胞悬液中加400 μl缓冲液和5 μl 7-ADD溶液，流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。不加Annexin V-FITC和7-AAD的重悬细胞作为阴性对照组。

3.实时荧光定量PCR检测VEGF和mRNA表达情况：采用Trizol Reagent试剂盒提取两组重悬细胞的RNA，VEGF引物如表2，扩增片段大小166 bp，内参β-actin 161 bp，实时荧光定量PCR实验条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s；40 cycles。

表2 VEGF引物

三、数据分析

利用SPSS13.0进行统计学分析，测量的数据以均数±标准差来表示，采用t检测进行组间统计学分析，当P<0.05时，差异有统计学意义。

结 果

一、两组的LECs密度及PEDF mRNA相对转录水平比较

高密度组的LECs密度显著高于低密度组的LECs密度(P<0.001)，PEDF的mRNA相对转录水平，高密度组显著高于低密度组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表3。

表3 两组的LECs密度及PEDF mRNA相对转录水平比较

二、加PEDF干预后LECs的增殖和凋亡结果

加PEDF实验组的细胞在培养24、48和72 h后光学显微镜下观察，与对照组相比，细胞形态未发生明显变化。加PEDF实验组培养72 h后，G2和S期的细胞比率远高于对照组(P<0.001)，凋亡率显著低于对照组(P<0.001)。上述结果表明PEDF对HLE-B3细胞的凋亡具有一定的抑制作用。见图1和表4。

表4 加PEDF培养组和对照组细胞的凋亡率和G2+S期的细胞比率

三、VEGF的mRNA相对表达水平

加PEDF实验组VEGF mRNA相对表达水平显著低于对照组，相对表达降低了75.3%，具有统计学差异(P<0.001)。见表5。

表5 VEGF mRNA相对表达水平比较

讨 论

PEDF基因和表达蛋白广泛分布于成人的眼内视网膜、睫状体、角膜、脉络膜中[8-10]。有研究称人体内PEDF主要是保护视网膜及促进分化作用[11，12]。Hermann等人通过相关性研究发现PEDF具有抑制血管异常增生的作用[13]。Golan等发现鼠眼的晶状体上皮细胞存在PEDF的表达[14]。Huang等应用cDNA测序技术检测出人眼晶状体上皮细胞中PEDF基因，并证明其与白内障的产生相关联[15]。但目前还没有研究指出PEDF和LECs的增殖有关联。本研究结果表明当LECs处于低密度时，PEDF水平也降低。通过细胞体外实验，证明PEDF能够抑制LECs的凋亡，并降低VEGF表达。作为和细胞周期相关的细胞因子，PEDF是一种在G0期反应细胞增殖能力的特定基因[16-18]。有报道称PEDF在一些和年龄有关疾病的发生和发展中有一定的作用[19]。

图1 LECs的增殖和凋亡情况

本研究以人的晶状体上皮细胞作为研究对象，探究了PEDF在LECs中的作用。结果表明PEDF具有抑制LECs凋亡，减少VEGF表达的作用。根据以往文献报道，在晶状体的发生和发展过程中，PEDF的作用可通过自分泌，旁分泌，抗肿瘤，抗氧化，抗血管再生的刺激发挥出来。本研究可以为晶状体的生长和发展过程，甚至是白内障的发生和发展过程提供进一步的指导作用。

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