骨折后深静脉血栓形成患者的内源性抗凝能力评价

苏玉，赵洁，吴俊

(1.北京积水潭医院检验科，北京 100035；2.北京大学人民医院检验科，北京 100044)

·临床实验研究·

骨折后深静脉血栓形成患者的内源性抗凝能力评价

苏玉1，赵洁2，吴俊1

(1.北京积水潭医院检验科，北京 100035；2.北京大学人民医院检验科，北京 100044)

目的观察骨折后下肢深静脉血栓形成(DVT)患者的内源性抗凝能力及其在DVT形成中的作用。方法选择北京积水潭医院骨折后下肢DVT患者95例作为DVT组，体检健康者100例作为健康人对照组。收集患者术后第3天枸橼酸钠抗凝血浆标本，检测纤维蛋白降解产物(FDP)和D-二聚体(DD)；用Thrombopath发色底物显色法检测内源性抗凝能力指标Protac凝血抑制率(PICI)；收集患者血清检测高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。结果DVT组FDP、DD均高于健康人对照组，差异均有统计学意义(P均<0.01)，DVT组PICI(%)低于健康人对照组(82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01)；DVT组≥65岁患者较<65岁患者PICI下降约4.8%(P<0.05)；当PICI的cut-off值为84.2%时，卡方检验显示，DVT与健康人对照组PICI阳性率差异有统计学意义(P<0.01)；相关性分析显示PICI与FDP、DD呈负相关，与HDL-C呈正相关(r分别为-0.318、-0.336和0.284，P均<0.01)；Logistic回归分析显示PICI是静脉血栓的危险因素，OR值为1.243(P<0.01)。结论骨折后血栓患者的内源性抗凝能力降低。

内源性抗凝能力；深静脉血栓；骨折；Protac凝血抑制率

深静脉血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是骨科患者的严重并发症[1-2]。根据北京积水潭医院血管外科的统计数据，创伤性DVT发病率高达43.2%[3]。DVT发病原因复杂，人体内源性抗凝系统功能异常会增加静脉血栓的发生风险[4-5]。目前，常用的DVT实验室检查指标有D-二聚体(D-dimer，DD)、纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDP)等[6-8]，而内源性抗凝检查的实验成本较高[9]，尚缺乏能全面有效地评价患者内源性抗凝能力的独立的实验室指标。

HemosIL Thrombopath试剂是一种新的评价内源性抗凝功能的商品化检测试剂，将患者血浆分为2份，一份加入促凝试剂以激活凝血酶，另一份加入促凝试剂和蛇毒提取物Protac试剂以激活内源性抗凝过程；2份血浆分别通过自动化血凝分析仪检测吸光度并计算Protac引起的凝血抑制率(protac-induced coagulation inhibition percentage，PICI)。目前国内外尚未见用HemosIL Thrombopath试剂检测骨折血栓患者内源性抗凝能力的报道，本研究用病例对照研究评价骨折血栓患者内源性抗凝能力，并分析其临床意义。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2016年5月至2017年5月于北京积水潭医院血管外科就诊的下肢骨折后DVT患者95例(DVT组)，入组标准为：曾于7日内发生下肢骨折，于北京积水潭医院创伤骨科手术治疗，术前经静脉血管造影确诊DVT、使用低分子量肝素抗凝治疗，术后使用利伐沙班抗凝治疗，由于华法林对内源性抗凝能力存在影响，故严格排除曾使用华法林的患者。DVT组男45例，女50例，年龄21～87岁，中位年龄为61岁，股骨骨折43例，胫腓骨骨折24例，膝关节骨折15例，踝关节骨折10例，多发骨折3例。选取同期于北京积水潭医院社区保健科就诊的性别、年龄相匹配的体检健康者100例(健康人对照组)，无血栓病史，无抗凝药物治疗史，其中男57例，女43例，年龄36～81岁，中位年龄60岁。2组年龄、性别比差异无统计学意义(P均>0.05)。

1.2标本采集和处理 骨科手术后3 d采集DVT组患者静脉血，抽血前曾使用利伐沙班常规抗凝治疗。采集DVT组患者静脉血，枸橼酸钠抗凝，用于内源性抗凝能力、FDP和DD检测。枸橼酸钠抗凝血在室温下以2 000×g离心10 min，即刻检测FDP和DD；随后2 h内分离血浆，-80 ℃冻存，用于后续的内源性抗凝能力检测，在检测前，37 ℃水浴融解冻存的血浆标本。采集DVT组患者静脉血于分离胶真空采血管，室温下静置15 min，2 000×g离心10 min分离血清，即刻检测高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。

1.3主要仪器和试剂 ACL-TOP 500型血凝分析仪(美国Werfen公司)和HemosIL Thrombopath发光底物显色试剂(美国HemosIL公司)用于内源性抗凝能力PICI检测；CS-2100型血凝分析仪(日本Sysmex公司)及FDP(日本积水公司)及DD(德国西门子公司)试剂用于FDP和DD检测。7180型全自动生化分析仪(日本日立公司)和HDL-C试剂(北京柏定公司)用于HDL-C检测。

1.4PICI、FDP、DD和HDL-C的检测 在满足质量控制规则的条件下，用发光底物显色法检测PICI：将血浆标本稀释后分装入2个反应杯，分别加入激活物A(含有蛇毒提取物Protac)和激活物B(不含Protac)；37 ℃孵育，同时检测2个反应杯的A值(ThP-A和ThP-B)，单位为吸光度变化/分钟(mAbs/min)，PICI=(ThP-A-ThP-B)/ThP-B×100%。用胶乳免疫比浊法检测FDP，用颗粒增强免疫比浊法检测DD，用直接法-过氧化氢酶清除法检测HDL-C。

2 结果

2.1健康人和骨折后DVT患者的内源性抗凝能力评价 DVT组与健康人对照组FDP(μg/mL)分别为11.8(6.8，16.7)和1.2(1.1，1.5)，差异有统计学意义(P<0.01)，DD(mg/L FEU)分别为4.59(2.43，7.53)和0.24(0.15，0.37)，差异有统计学意义(P<0.01)。

健康人对照组和DVT组PICI(%)分别为87.8±3.6和82.8±7.2，差异有统计学意义(P<0.01)。DVT组内源性抗凝能力平均降低约5.7%；健康人对照组和DVT组PICI的最高值几乎一致，分别为94.6%和94.8%，而最低值分别为75.9%和45.4%。见图1。

注：长线表示平均值，短线表示标准差，虚线表示cut-off值。

图1 健康组与血栓组内源性凝血能力PICI比较

根据HemosIL Thrombopath试剂盒说明书推荐和文献报道[9]，用100例健康人的PICI平均值减1个标准差得到cut-off值，为84.2%，以此cut-off值作列联表进行卡方检验，差异有统计学意义(χ2=27.1，P<0.01)。DVT组PICI阳性患者为48%(46/95)，约二分之一的DVT骨折后血栓患者存在内源性抗凝功能异常，见表1。

表1 DVT组与健康人对照组的内源性抗凝能力比较

2.2血栓患者中不同性别、年龄和骨折部位的内源性抗凝能力评价 健康人对照组男性PICI(%)为87.6±3.6，女性为88.7±3.5，差异无统计学意义(P=0.470)；≥65岁34人，<65岁66人，PICI(%)分别为87.6±3.6和88.1±3.5，差异无统计学意义(P=0.651)。

DVT组不同性别、骨折部位患者PICI差异也无统计学意义(P均>0.05)，但≥65岁患者较<65岁患者的PICI下降(P<0.05)，平均值下降约4.8%。见表2。

表2 DVT患者不同性别、年龄和骨折部位的内源性抗凝能力评价

参数人数(百分比)PICI(%)P性别 男45(47.4%)82.1±8.70.376 女50(52.6%)83.4±5.5年龄 <65岁59(62.1%)84.3±7.2<0.05 ≥65岁36(37.9%)80.3±6.4骨折部位 股骨43(45.2%)80.7±8.30.515 胫腓骨24(25.3%)85.1±5.3 膝关节15(15.8%)83.5±6.7 踝关节10(10.5%)84.7±5.2 多发骨折3(3.2%)83.6±3.0

2.3PICI与FDP、DD、HDL-C的相关分析和logistic回归分析 分析PICI与FDP和DD的相关性发现，PICI与FDP和DD存在负相关，相关系数分别为-0.318(95%CI：-0.439～-0.186)和-0.336(95%CI：-0.455～-0.205)，P均<0.01；分析PICI与HDL-C相关性发现，HDL-C与PICI呈正相关，相关系数0.284(95%CI：0.142～0.413)，P<0.01。

将健康人对照组和DVT患者组的性别、年龄和PICI进行二元Logistic回归分析，结果显示仅PICI有统计学意义(P<0.01)，OR值1.243(95%CI: 1.149～1.344)，PICI是DVT的危险因素。

3 讨论

2009年，Toulon等[9]首次报道了用HemosIL Thrombopath试剂检测内源性抗凝能力的多中心研究。随后数篇关于内源性抗凝能力检测的文献主要集中在肿瘤研究领域[10-12]。本研究首次用PICI评价骨科血栓患者的内源性抗凝能力，其在临床凝血状态评价中具有潜在应用价值。

研究发现，DVT组与健康人对照组FDP和DD差异有统计学意义，与文献报道一致[8]；DVT患者PICI低于健康人对照组，约一半DVT患者存在内源性抗凝缺陷；在DVT患者中，PICI最低值为45.4%，说明该患者的内源性抗凝能力下降较严重，此类患者的PICI检测可能具有重要意义。在分析年龄与PICI关系时发现，≥65岁老年患者PICI显著下降，说明年龄对内源性抗凝能力存在一定影响。将DVT患者按骨折部位分组，不同骨折类型的PICI差异无统计学意义，说明骨折部位不同对内源性抗凝能力的变化影响不大。PICI与HDL-C呈正相关，HDL-C水平与内源性抗凝能力可能存在联系。HDL-C具有抗炎、保护血管内皮等功能，可能是抗凝系统的保护因素[13]。

根据文献报道，用HemosIL Thrombopath检测内源性抗凝能力，可以有效检出蛋白C及蛋白S通路异常、狼疮抗凝物和Ⅴ因子Leiden突变[9]。但PICI只能评价整体的内源性抗凝能力，不能测出具体哪一类机制异常。如发现DVT患者PICI偏低，内源性抗凝下降，还应检测蛋白C、蛋白S、狼疮抗凝物和Ⅴ因子Leiden等。PICI检测无法明确内源性抗凝能力异常的原因和机制，具有一定的局限性。

[1]Dahl OE, Caprini JA, Colwell CW,etal. Fatal vascular outcomes following major orthopedic surgery[J]. Thromb Haemost, 2005, 93(5): 860-866.

[2]Fukushima K, Takahira N, Uchiyama K,etal. The incidence of deep vein thrombosis(DVT) during hip arthroscopic surgery[J]. Arch Orthop Trauma Surg, 2016, 136(10): 1431-1435.

[3]刘建龙.创伤性DVT，我们的认识是否足够？[J].临床误诊误治,2017,30(1): 1.

[4]Maki H, Nishiyama M,Shirakawa M. Simultaneous left ventricular and deep vein thrombi caused by protein C deficiency[J]. Case Rep Med, 2017, 2017: 4240959.

[5]Lertnawapan R,Sakonlaya D. Lupus protein-losing enteropathy patient with protein C and protein S deficiency-induced thrombosis: A case report with review of the literature[J]. Acta Reumatol Port, 2017, 42(3): 265-268.

[6]Hou H, Ge Z, Ying P,etal. Biomarkers of deep venous thrombosis[J]. J Thromb Thrombolysis, 2012, 34(3): 335-346.

[7]Schaefer JK, Jacobs B, Wakefield TW,etal. New biomarkers and imaging approaches for the diagnosis of deep venous thrombosis[J]. Curr Opin Hematol, 2017, 24(3): 274-281.

[8]Yang Y, Zan P, Gong J,etal. D-dimer as a screening marker for venous thromboembolism after surgery among patients younger than 50 with lower limb fractures[J]. Clin Appl Thromb Hemost, 2017, 23(1): 78-83.

[9]Toulon P, Smirnov M, Triscott M,etal. A new chromogenic assay(HemosIL ThromboPath) is sensitive to major prothrombotic risk factors affecting the protein C pathway. Results of a multicenter study[J]. Thromb Res, 2009, 124(1): 137-143.

[10]Roselli M, Ferroni P, Riondino S,etal. Functional impairment of activated protein C in breast cancer-relationship to survival outcomes[J]. Am J Cancer Res, 2016, 6(6): 1450-1457.

[11]Ferroni P, Riondino S, Portarena I,etal. Association between increased tumor necrosis factor α levels and acquired activated protein C resistance in patients with metastatic colorectal cancer[J]. Int J Colorectal Dis, 2012, 27(12): 1561-1567.

[12]Ferroni P, Martini F, Portarena I,etal. Early changes of a novel APC-dependent thrombin generation assay during chemotherapy independently predict venous thromboembolism in cancer patients—a pilot study[J]. Support Care Cancer, 2012, 20(11): 2713-2720.

[13]Belaj K, Hackl G, Rief P,etal. Changes in lipid metabolism and extension of venous thromboembolism[J]. Ann Nutr Metab, 2014, 64(2): 122-126.

Evaluationforendogenousanticoagulationpotentialofbonefracturepatientswithdeepvenousthrombosisformation

SUYu1,ZHAOJie2,WUJun1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BeijingJishuitanHospital,Beijing100035; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,People′sHospital,PekingUniversity,Beijing100044,China)

ObjectiveTo evaluate the endogenous anticoagulation potential of bone fracture patients and its relationship with deep venous thrombosis formation (DVT).MethodsA total of 95 DVT patients after bone fracture and 100 healthy subjects as control from Beijing Jishuitan Hospital were included in this study. On the third day after orthopedic surgery, the citrated anticoagulant plasma samples were collected and fibrin degradation products (FDP) and D-dimer (DD) were measured. Protac-induced coagulation inhibition percentage (PICI) was measured with ThromboPath (ThP) chromogenic assay as the marker of endogenous anticoagulation potential. The serum samples from patients were collected to measure the concentration of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C).ResultsBoth FDP and DD values of DVT patient group were significantly higher than those of healthy control group (allP<0.01). The PICI (%) of DVT patients group was significantly lower than that of healthy control group (82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P<0.01). The PICI of patients ≥65 years old was 4.8 percent lower than that of the patients <65 years old (P<0.05) in DVT group. When the cut-off value for PICI was set as 84.2%, a significant difference was showed between DVT and control group by Chi-Square test (P<0.01). PICI was negatively correlated with FDP and DD (r=-0.318,-0.336,bothP<0.01), but positively correlated with HDL-C (r=0.284,P<0.01). Logistic regression analysis suggested that PICI was a risk factor of DVT with odds ratio 1.243 (P<0.01).ConclusionThe endogenous anticoagulation potential may be severely impaired in DVT patient after bone fracture.

endogenous anticoagulation potential; deep venous thrombosis; bone fracture; Protac-induced coagulation inhibition percentage

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.10

北京市卫生系统第五批高层次人才培养计划(2015-3-034)；人社部留学人员科技活动项目([2015]192)；首都特色临床医疗研究(Z141107006614012)；教育部留学归国人员科研启动基金([2013]693)。

苏玉，1987年生，女，技师，博士，主要从事血栓分子标志物研究;赵洁，1975年生，女，主管技师，大学本科，主要从事生物化学检验工作。苏玉和赵洁对该研究具有同等贡献，同为第一作者。

吴俊，主任医师，博士，研究生导师，E-mail:wujunpostbox@sina.com。

R446.11;R619

A

2017-08-29)

王海燕)