复合酶制剂对甜酒酿面包发酵烘焙特性的影响

张可欣，蒋 慧，汤晓娟，苏晓琴，徐 岩，黄卫宁,*，李 宁，Arnaut FILIP

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.广州焙乐道食品有限公司，广东 广州 511400；4.焙乐道食品集团，比利时 布鲁塞尔 1201）

复合酶制剂对甜酒酿面包发酵烘焙特性的影响

张可欣1，蒋 慧1，汤晓娟1，苏晓琴1，徐 岩2，黄卫宁1,*，李 宁3，Arnaut FILIP4

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.广州焙乐道食品有限公司，广东 广州 511400；4.焙乐道食品集团，比利时 布鲁塞尔 1201）

选用中国特色传统甜酒曲制作的甜酒酿进行面包制作，通过面团流变学分析、生物化学分析、激光共聚焦显微观察、感官评定等多种手段对甜酒酿面团及面包的品质进行综合评估，与普通小麦面包进行对比，并使用天然酶制剂来提高含甜酒酿面包的发酵烘焙特性。结果表明：含甜酒酿面团游离巯基含量增加，蛋白酶活力较强，甜酒酿对面包面团面筋网络结构的形成有破坏作用，会导致面包内聚性、弹性下降，降低口感评分。但甜酒酿能给面包带来更加诱人的色泽，其特有的酒香使面包更加可口，通过酶制剂的作用，面团面筋网络结构得到强化，含酶甜酒酿面包品质全面提升，比普通小麦面包更受欢迎。

甜酒酿；面筋网络；面包品质；酶

面包作为世界性的主食，其配料由过去单一的小麦演变为目前丰富多样的各类谷物，再通过适当的香料、改良剂的添加，来满足人们对于面包风味独特、营养丰富、食用安全的消费需求。而随着化学合成添加剂的安全问题不断暴露，开发天然、绿色、安全的食品配料来改善面包品质势在必行。

甜酒酿是中国传统发酵食品，它通过糯米与甜酒曲发酵而成，酸甜可口、营养丰富，并带有淡淡的酒香，深受广大人民的喜爱[1]。蒸熟的糯米在甜酒曲中的霉菌和酵母菌的作用下，淀粉糖化降解成糖类，并进一步发酵为乙醇和有机酸，蛋白质降解成肽和氨基酸，伴随着多种生化反应的进行，使得甜酒酿具有丰富的葡萄糖、氨基酸、有机酸、钙、磷、铁等营养物质，独特的醇、酯类风味物质，不同米基质的酒酿还具有不同程度的抗氧化活性[2-3]。基于甜酒酿的风味、营养优势，其很适合作为食品加工的配料进行深度开发，目前已有研究人员将其用于乳酸菌饮料[4]、奶酪[5]、鲣鱼[6]等产品的加工制作中来改善产品的风味和营养。

甜酒酿与面制品的搭配别具特色。江南地区的人民用酒酿制作的馒头、酒酿饼，清甜松软、酒香怡人。李志建等[7]将酒酿与酵母混合发酵，改善了馒头风味。黄璐等[8]用酒酿滤出汁替代30%的水制作面包，发现面包的风味、品质有明显改良，并且延长了面包的货架期。然而甜酒酿为固态发酵产物，其固形物含量在50%以上，若只取滤出汁会造成极大的浪费[9]。而目前鲜见到关于甜酒酿对面包品质影响的其他报道。因此，本实验旨在研究甜酒酿对面包发酵烘焙特性的影响，探索其原因，并通过酶制剂进一步提升甜酒酿面包的发酵烘焙品质，为丰富天然、美味、营养的面包配料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高级面包粉 中粮面业鹏泰有限公司；甜酒曲广西农家土曲；即发活性干酵母 乐思福管理（上海）有限公司；黄油 东海粮油工业有限公司；糯米、白砂糖、食盐 市售；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOX） 荷兰皇家帝斯曼集团；谷氨酰胺转移酶（transglutaminase，TG） 江苏一鸣生物股份有限公司；木聚糖酶（xylanase，XYL） 东莞泛亚太生物科技有限公司；无水乙醇、葡萄糖、氢氧化钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、3,5-二硝基水杨酸、茚三酮、甘氨酸、半胱氨酸等试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HHS-150B型恒温恒湿培养箱 南京恒裕电子仪器厂；SP-752型紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Mixolab混合实验仪 法国Chopin公司；TDL-5离心机上海安亭科学仪器厂；LSM710激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM） 德国蔡司公司；SM-25搅拌机、SPC-40SP醒发箱、SM-503烤箱、SM-302切片机 新麦机械（无锡）公司；CT3质构仪 美国Brookf i eld公司。

1.3 方法

1.3.1 甜酒酿制作及基本发酵特性测定

根据以下方法制作甜酒酿并测定甜酒酿发酵过程中的还原糖含量和乙醇体积分数。

甜酒酿制作选用市售糯米，浸泡5 h后大火蒸制30 min，随后淋饭摊凉，甜酒曲接种量为0.5%（m/m），在30 ℃恒温箱中发酵48 h。

还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，参考Breuil[10]、吴逊[11]等的实验方法并改进。取5 g甜酒酿样品，加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液使酶失活，再加入35 mL水，在45 ℃条件下水浴振荡1 h，冷却后定容至100 mL，混匀、静置、沉淀。吸取适量上清液于250 mL容量瓶，加入5 mL 100 g/L的乙酸锌溶液和5 mL 100 g/L的亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30 min后取上清液过滤（弃初滤液）。取滤液1 mL于10 mL比色管中，加入2 mL DNS试剂，补水至5 mL，摇匀，沸水浴5 min后取出，流水下冷却，最后补加水至10 mL，摇匀，在520 nm波长处测定吸光度。根据吸光度及葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。

乙醇体积分数通过蒸馏-重铬酸钾显色法测定。由于酒酿中大量的还原糖会影响乙醇与重铬酸钾的显色反应，因此需通过蒸馏将两者分离，再通过重铬酸钾显色法测定馏出液的乙醇体积分数[12]。

1.3.2 各面团吸水率及热机械学特性测定

根据Kim等[13]描述的方法，通过混合实验仪测定小麦面团（WB）和含甜酒酿的面团（FRB）、含酶及甜酒酿的面团（MFRB）的最适吸水率，并采用Chopin+协议对各面团的热机械学特性进行测定。

1.3.3 面团生物化学分析

1.3.3.1 面团冻干粉的制备

表1 普通小麦面包及甜酒酿面包配方Table 1 Formulations of wheat bread and bread with fermented glutinous rice

按照参考文献[14]的方法，根据表1中配方制备不含酵母的面包面团（WB、FRB、MFRB），面团醒发后，立即冷冻，随后放入冷冻干燥机冻干。冻干的样品研磨为粉末，一式3 份，用于后续测试。

1.3.3.2 冻干粉可提取α-氨基态氮含量的测定

1.25 g冻干粉悬浮于25 mL 1 mol/L的NaCl溶液中，振荡2 h，随后取上清液于18 000×g、4 ℃离心30 min，取上清液。根据Thiele等[15]的描述，采用茚三酮法测定可提取α-氨基态氮的含量，以甘氨酸为标准样品作吸光度标准曲线。

1.3.3.3 冻干粉游离巯基含量测定

游离巯基的含量测定采用Steffolani等[16]的方法进行。50 mg冻干粉在1.5 mL缓冲液（8 mol/L尿素、3 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、10 g/L十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8）和50 μL显色剂（8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、10 g/L SDS、0.2 mol/L Tris-HCl和10 mmol/L 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸），pH 8）中漩涡振荡25 min，随后于3 000×g离心10 min，取上清液在412 nm波长处测定吸光度。以半胱氨酸为标准样品作吸光度标准曲线。

1.3.4 激光共聚焦显微镜观察面包面团显微结构

根据表1配方制备不含酵母的面包面团（WB、FRB和MFRB），38 ℃醒发1 h后，用剪刀取约1 g的面团置于冰冻切片机托盘上，用莱卡包埋剂包埋，置于-20 ℃冷冻一夜后，用冰冻切片机切取20 μm厚的切片，置于载玻片上。参考Silva等[17]描述的方法，用丙酮为溶剂，配制质量分数为0.25%的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和质量分数为0.025%的罗丹明B荧光染料，对切片进行染色，1 min后用去离子水脱色，随后盖上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜下观察。目镜放大倍数10，物镜放大倍数20。FITC和罗丹明B的激发与发射波长分别为488、518 nm和568、625 nm。

1.3.5 面包发酵烘焙制作工艺

根据表1配方制备不含酵母的面包面团（WB、FRB和MFRB）。将除黄油外的其他配料慢速搅拌2 min，再快速搅拌4 min形成面团。加入黄油后，慢速搅拌1 min，快速搅拌3 min至面筋网络形成。室温下覆膜松弛10 min后，切割、搓圆，再次覆膜松弛10 min，整型（90 g/个）。随后放入醒发箱（温度38 ℃、相对湿度85%）醒发65 min，放入烤箱（上火170 ℃、下火210 ℃）烤制21 min。

1.3.6 面包烘焙品质分析1.3.6.1 面包比容测定

面包烤制后室温冷却2 h，测定其质量和体积，并根据下式计算比容。通过油菜籽置换法测定体积。

1.3.6.2 面包全质构测定

面包室温冷却2 h后立即用切片机切成10 mm的均匀薄片，取中心两片质地均匀的面包进行全质构测定。参数设置如下：探头型号P/36，感应力5 g，压缩程度40%，测试前速率3.0 mm/s，测试中速率1.0 mm/s，测试后速率3.0 mm/s，测试间隔时间1 s。每组面包重复测试3 次，结果取平均值。

1.3.6.3 面包感官分析

通过9 分嗜好法对面包的外观、颜色、风味、口感和整体可接受度进行喜好评分[18]。1～9 分代表对样品的喜欢程度，分数越高代表对样品越喜欢，1 分代表极度不喜欢，9 分代表极度喜欢。评定小组由20 名（10 名女性、10 名男性）受过感官评定培训的人员组成。

1.4 数据处理与统计分析

运用Excel 2013、Origin 9.1及SPSS 19.0等软件进行实验数据分析，采用方差分析法进行显著性分析，显著性差异水平取α=0.05。

2 结果与分析

2.1 甜酒酿发酵过程中还原糖含量和乙醇体积分数变化

由图1可知，发酵12 h后，甜酒酿中还原糖的含量开始增加，而乙醇体积分数快速增加的起点则在发酵24 h左右。这是由于甜酒酿发酵初期，根霉菌大量繁殖并对糊化的糯米进行糖化作用，产生大量葡萄糖，随后，酵母分解葡萄糖，发酵产生乙醇[19]。而48 h后，甜酒酿中还原糖和乙醇积累到一定的程度，且增加趋势减缓。还原糖和乙醇的存在使酒酿具有香甜可口、醇香怡人的特点，但也使酒酿具有较强的还原性，可能对二硫键的交联不利。为使甜酒酿面包具有足够的酒香和甜味，选取发酵48 h的甜酒酿作为面包配料进行后续研究。

2.2 面团吸水率及热机械学特性

由表2可以发现，FRB吸水率明显低于WB（P＜0.05），这可能是由于甜酒酿引入面团后，对面筋形成造成阻碍，导致面筋不能充分吸收水分形成具有黏弹性的网络结构。而熟糯米接入甜酒曲后，在霉菌和酵母的代谢作用下逐渐降解，其吸水能力也在下降。此外，发酵产生的乙醇等液体代谢产物也对吸水率产生了影响。

表2 酒酿对面团热机械学特性的影响Table 2 Effect of fermented glutinous rice on thermomechanical characteristics of dough

C1宽度能够反映面团弹性，C1-C2代表蛋白质弱化度[20]，甜酒酿使面团C1宽带显著减小（P＜0.05），C1-C2值显著增加（P＜0.05），说明甜酒酿能够降低面团弹性，弱化蛋白质网络结构，对面团面筋网络结构有破坏作用。虽然与蛋白质相关的参数变化表明甜酒酿对面团产生了负面影响，但面团稳定时间却有所延长，这与Mironeasa等[21]的实验结果相似，说明甜酒酿对蛋白质网络结构的破坏并没有达到不可接受的程度，此外，酒酿中淀粉支链可能与面筋蛋白交联形成具有一定黏弹性的三维凝胶网络结构[22]。

在酶的作用下，MFRB吸水率相比于FRB显著增加（P＜0.05），C1宽度显著增加（P＜0.05），C1-C2显著降低（P＜0.05），这说明面团吸水能力得到改善，面团弹性增强，蛋白质网络弱化程度减轻，复合酶对面团面筋产生了加固作用，虽与小麦面团相比仍有不及，但差距不大。

2.3 面团游离巯基含量及蛋白酶水解活力变化

表3 面团游离巯基含量及α-氨基态氮含量变化Table 3 Changes in free sulfhydryl and α-amino nitrogen contents in dough

面团特性绝大程度上取决于水合小麦面筋蛋白的黏弹特性，而二硫键形成的黏性结构的超分子交联能够影响面筋的黏弹性[23]。游离巯基的含量能够表征面筋和面团形成过程中共价键形成和蛋白质的交联情况[24]。不同面团冻干粉的游离巯基含量见表3。引入甜酒酿后，FRB游离巯基含量显著增加（P＜0.05）。Capuani等[25]的研究显示，在还原性条件下，面团游离巯基含量增加。甜酒酿发酵过程中能够产生大量还原糖及乙醇等还原性物质，将甜酒酿加入面团后，部分二硫键被还原为游离巯基，面筋网络结构被部分破坏，面筋强度降低（表2），弹性变差，可能对面包品质带来负面影响。

WB、FRB及MFRB的蛋白酶水解活力是通过游离α-氨基态氮的含量来表示的。Thiele[15]、Loponen[26]等都通过这种方法监测酸面团发酵过程中蛋白质的水解程度。如表3所示，面团醒发前，α-氨基态氮含量差异并不十分显著（P＞0.05），而与WB相比，FRB在醒发后蛋白质水解程度明显增加（P＜0.05）。面团发酵过程中，主要的蛋白酶水解活力来源于面粉的内源酶[27]，WB在醒发后蛋白质水解程度有一定幅度的增加。而在甜酒酿中，来自酒曲的根霉、毛霉和曲霉除了有较强的淀粉水解能力，同时还具有蛋白质水解能力[28]。随着酒酿发酵的进行，一般在24 h后霉菌的菌丝和孢子开始自溶，也会释放蛋白酶[19]。因此，FRB醒发后，蛋白质水解程度明显增加，这也就意味着面团的蛋白质网络受到了一定程度的破坏，面筋结构弱化，这可能会影响面团的持气力及面团醒发高度。

而引入酶制剂参与发酵后，MFRB中游离巯基和可提取α-氨基态氮的含量较FRB减少，接近WB。Gujral等[24]发现通过TG处理后，米粉面团中游离巯基和α-氨基态氮的含量均有下降。这可能是由于TG催化的转酰基反应使蛋白质构象发生了变化，游离巯基有更多的机会靠近并形成二硫键。Ahn等[29]也得到相似的结果。本研究的结果说明在酶的作用下，蛋白质的游离伯胺通过酶的催化与肽交联，数量大幅度减少，而面团中游离巯基也被氧化，重新交联成二硫键。这些结果表明，酶制剂可以使面团原本被破坏的面筋网络重新连接，使面团品质得到改善。

2.4 面包面团微观结构

图2 WB（a、b）、FRB（c、d）、MFRB（e、f）面团的CLSM显微结构Fig. 2 CLSM images of WB (a, b), FRB (c, d), and MFRB (e, f)

使用CLSM研究了甜酒酿及酶制剂对面团微观结构的影响（图2）。其中淀粉颗粒被染成绿色，面筋蛋白被染为红色。面筋蛋白由单体醇溶蛋白和高分子麦谷蛋白构成，被认为是小麦面团黏弹特性的主要来源[30]。构成麦谷蛋白大聚体的单体通过有“流变功能”的二硫键进行连接，面筋的内聚性取决于共价和非共价交联，尤其取决于共价交联[31-32]。

对比图2a、c、e，可以发现引入甜酒酿之后，面筋网络变得稀疏而细碎，这与甜酒酿对面筋的稀释作用、对二硫键的破坏作用和蛋白酶对面筋蛋白的水解作用均有关。已有许多研究人员使用GOX以及TG来强化面团面筋[33-35]。本研究中，MFRB在GOX作用下，游离巯基重新氧化交联，而在TG的作用下，游离的伯胺和肽结合的谷氨酰胺残基上γ-甲酰基进行了转酰基反应，这都使细碎的面筋重新聚合成大片的网络结构，虽然交联程度仍略不及WB，但差异并不大。这说明经过酶作用后，面团面筋网络结构得到改善，为得到更高品质的面包奠定了基础。

对比图2b、d、f，可以发现FRB和MFRB中除普通小麦淀粉颗粒（直径较大的A型淀粉颗粒和直径较小的B型淀粉颗粒）外，还有细小的已糊化的米淀粉碎片填充在面筋网络结构中，较高的填充度可能有助于酒酿面团持气率的增加。

2.5 面包烘焙品质分析

2.5.1 面包的烘焙品质

表4 WB、FRB、MFRB的比容及全质构参数Table 4 Specif i c volume and TPA parameters of WB, FRB and MFRB

如表4所示，面团体系引入甜酒酿后，面团面筋网络虽然受到了破坏，但面包比容并没有显著降低（P＞0.05），这可能是因为面筋网络并没有被破坏到不可接受的程度。而MFRB的比容比FRB显著提高了4.9%（P＜0.05），这是由于GOX和TG对面筋结构进行了强化，改善了面团品质，使面团保持气体的能力得到提高。同时，XYL与GOX的共同使用也有助于面包比容的增加[33]。

全质构参数能够较为准确地描述面包的质地特性，硬度、胶着性、咀嚼性与面包品质呈负相关，而回复性、内聚性和弹性与面包品质呈正相关[36]。3 种面包的全质构分析结果如表4，虽然比容相近，但相比于WB，FRB的硬度、胶着性、咀嚼性显著增加（P＜0.05），而回复性、内聚性和弹性都显著降低（P＜0.05），表明甜酒酿对面包质地具有负面影响。结合面团品质的分析

结果可以推测，甜酒酿给面包带来的负面影响主要是由于面筋网络结构的弱化导致的。通过酶作用后，MFRB面包全质构参数比FRB有了明显的改善（P＜0.05），其中内聚性甚至显著超过了WB（P＜0.05）。GOX能够氧化酒酿中的葡萄糖，生成过氧化氢，有利于二硫键的形成[37]，而TG能催化不同源和同源蛋白质之间伯胺和肽结合的谷氨酰胺残基上γ-甲酰基的转酰基反应，有利于形成蛋白质高聚物[29,38]，两者有针对性地解决了甜酒酿对面团面筋网络带来破坏作用的问题。XYL对戊聚糖的降解能够释放水分，促进面筋充分形成，同时能够增大面包比容，提高面包品质[39]。因此，经复合酶作用后的酒酿面包质地品质得到了大幅度的提高。

2.5.2 面包感官分析

图3 WB、FRB、MFRB的感官评定Fig. 3 Sensory evaluation of WB, FRB and MFRB

3 种面包感官评定结果如图3，引入甜酒酿后，面包的外观变化并不大，而颜色、风味评分由不足6.0 分增加到7.0 分以上，但口感评分却由7.5 分降至6.0 分，这说明甜酒酿能够给面包带来诱人的风味和色泽，但也给口感带来了负面影响，这与前文分析面团面筋网络结构受到破坏，面包质构特性中硬度等增加、内聚性等降低息息相关。而通过复合酶制剂作用后，MFRB面包口感评分与WB相近，整体可接受程度也得到了最高分，最受消费者喜爱。

3 结 论

本研究从微观和宏观两个层面，针对甜酒酿对面包品质的影响进行了较为全面的分析，发现甜酒酿能够给面包带来较好的色泽和风味，具有开发为功能食品配料的潜力。但由于其含有蛋白酶和还原糖等物质，对面包面团的面筋网络结构破坏较大，使面包质地、口感变差，会对面包品质造成不利影响。通过GOX、TG和XYL 3 种酶的作用来提高甜酒酿面包的发酵烘焙品质，发现MFRB面筋网络结构被修复，MFRB质构特性明显提升（P＜0.05），总体感官评分已经超过WB，更加受人喜爱。综上所述，甜酒酿和酶制剂的结合能够从色泽、风味、口感、整体接受度等多个方面改善面包品质。本研究为丰富天然、美味、营养的面包功能性配料提供了一定的理论参考。

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Effect of Enzyme Combinations on Baking Properties of Bread with Fermented Glutinous Rice

ZHANG Kexin1, JIANG Hui1, TANG Xiaojuan1, SU Xiaoqin1, XU Yan2, HUANG Weining1,*, LI Ning3, Arnaut FILIP4
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;3. Guangzhou Puratos Food Co. Ltd., Guangzhou 511400, China;4. Puratos Group NV/SA, Brussels 1201, Belgium)

In this study, glutinous rice was fermented by traditional Chinese starter culture (Qu in Chinese) and used in bread making. The quality of bread and dough was evaluated through rheological analysis, biochemical analysis, confocal laser scanning microscopy and sensory evaluation. The quality of bread with fermented glutinous rice was compared with that of common wheat bread, and it was improved by enzyme addition. The results showed higher contents of free sulfhydryl and extractable α-amino nitrogen in dough with fermented glutinous rice than control dough, suggesting that fermented glutinous rice had a detrimental effect on the formation of gluten network in dough, declining the cohesiveness and elasticity of the resulting bread and decreasing the sensory score for taste. However, fermented glutinous rice resulted in bread with more attractive fl avor and better color. Addition of enzyme combinations enhanced the structure of the gluten network and signif i cantly improved the quality of bread with fermented glutinous rice, making it much more popular than common wheat bread.

fermented glutinous rice; gluten network; bread quality; enzyme

10.7506/spkx1002-6630-201801002

TS202.1

A

1002-6630（2018）01-0016-06

张可欣, 蒋慧, 汤晓娟, 等. 复合酶制剂对甜酒酿面包发酵烘焙特性的影响[J]. 食品科学, 2018, 39(1): 16-21.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801002. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Kexin, JIANG Hui, TANG Xiaojuan, et al. Effect of enzyme combinations on baking properties of bread with fermented glutinous rice[J]. Food Science, 2018, 39(1): 16-21. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801002. http://www.spkx.net.cn

2017-03-16

国家自然科学基金面上项目（31071595；31571877）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA022207C）；比利时国际合作项目（BE110021000）

张可欣（1993—），女，硕士研究生，研究方向为烘焙科学、功能配料与食品添加剂。E-mail：zkx_bs@163.com*通信作者简介：黄卫宁（1963—），男，教授，博士，研究方向为烘焙科学与发酵技术、谷物食品化学。

E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn